苹果MpSnRK2.4基因的克隆及转化

秦　源，邵　云，梁　东，邹养军

(西北农林科技大学 园艺学院，陕西 杨凌 712100)



苹果MpSnRK2.4基因的克隆及转化

秦源，邵云，梁东，邹养军

(西北农林科技大学 园艺学院，陕西 杨凌 712100)

[摘要]【目的】 从常用苹果砧木楸子中克隆MpSnRK2.4基因，并将其转化番茄(Lycopersicon esculentum)品种Micro-Tom，为研究其功能奠定基础。【方法】 以楸子幼叶为材料，通过RT-PCR扩增获得MpSnRK2.4基因的完整开放阅读框序列；利用Gateway技术构建pGWB411-SnRK2.4植物过表达载体，通过根癌农杆菌介导法将此载体转入Micro-Tom番茄中，通过卡那霉素筛选和转基因番茄RT-PCR鉴定，获得阳性转基因株系，利用qRT-PCR技术研究不同转基因株系中MpSnRK2.4基因的表达水平。【结果】 成功克隆到长度为1 220 bp的MpSnRK2.4基因片段，该基因包含长1 026 bp的完整开放阅读框，编码341个氨基酸残基。通过在线软件分析发现，该基因的gDNA序列包含8个内含子，9个外显子；预测编码蛋白MpSnRK2.4的分子质量为 38.475 ku，理论等电点(pI)为 6.06。系统进化树分析表明，MpSnRK2.4与水稻OsSAPK3蛋白的亲缘关系最近，序列比对显示MpSnRK2.4蛋白与已知的其他植物SnRK2s蛋白序列具有较高的同源性。转基因植株PCR鉴定结果表明，MpSnRK2.4基因已成功转入番茄植株中，经qRT-PCR发现，不同转基因株系的MpSnRK2.4基因表达量存在差异，其中株系1的表达水平最高。【结论】 克隆获得了MpSnRK2.4基因全长序列，并得到了10个含有该基因的Micro-Tom番茄转基因株系。

[关键词]楸子；SnRK2；基因克隆；转基因

蛋白质的可逆磷酸化是植物在非生物胁迫下体内能量代谢和信号转导的重要机制[1]。这个过程涉及到众多的磷酸酯酶和蛋白激酶，其中蔗糖非发酵相关蛋白激酶家族2(Sucrose non-fermenting-related protein kinase 2,SnRK2)是一个相对较小的植物专一性丝氨酸/丝氨酸蛋白激酶家族。

目前，通过基因工程已经得到了一些抗逆性增强的SnRK2s过表达植株，如SAPK4过表达水稻植株耐盐性和抗氧化胁迫能力增强[2]。烟草渗透胁迫激活蛋白激酶NtOSAK(Nicotiana tabacum osmotic stress-activated protein kinase)在烟草BY-2细胞中响应高渗胁迫[3]。AAPK(ABA-activated protein kinase)在蚕豆(Viciafaba)保卫细胞中响应干旱并参与调控阴离子通道活性和气孔关闭[4]。2009年，2个实验室分别获得了SnRK2.2/3/6三基因突变体，明确了ABA-依赖型SnRK2s在植物响应水分胁迫、种子成熟和萌发中的作用[5-6]。同年，研究者又发现了可溶性ABA受体，并因此理解了包括SnRK2s在内的ABA信号转导通道[6-7]。经过多年的研究，SnRK2家族成员现在被认为是植物响应渗透胁迫和依赖ABA发育过程中的主要参与者[8-12]。

SnRK2家族在高等植物中普遍存在，研究者发现其以不同的调控方式广泛地参与逆境信号传递过程和植物糖代谢，因此受到越来越多的关注[6]。目前相关研究主要集中在模式植物拟南芥和大田作物水稻、小麦、玉米上等，而在果树上的研究几乎空白，限制了它们在果树抗逆性改良方面的应用。此外，关于SnRK2家族基因参与植物糖代谢调控的研究刚刚起步，有待进一步深入。苹果是我国西北及华北地区农村的支柱产业，是我国农业部确定的优势农产品之一，也是世界上重要的水果。果树常常面临干旱缺水等逆境条件从而影响果实品质和产量，楸子是我国苹果的主要砧木之一，其特点是抗旱性强，嫁接后结果早。本研究通过克隆苹果MpSnRK2.4基因，将其转入番茄植株中，分析苹果MpSnRK2.4基因的功能，以期为了解苹果的抗逆分子机理提供理论基础，并对苹果的抗逆遗传改良提供参考。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1植物材料试验材料为楸子(Malusprunifolia)1年生盆栽苗。番茄品种为Micro-Tom，番茄种子购于南京泰丰园艺有限公司。

1.1.2菌株、质粒与试剂大肠杆菌Top10感受态细胞、农杆菌EHA105、pDonr 222载体、Gateway®pGWB411植物过表达载体，均由西北农林科技大学园艺学院果树逆境生物学研究团队保存；TaqDNA 聚合酶、克隆载体pMD19-T购于Takara宝生物工程有限公司；质粒微量抽提试剂盒以及DNA片段凝胶回收试剂盒等购于天根生化科技有限公司；构建Gateway载体所需BP反应酶和LR反应酶购于美国Invitrogen公司。引物由上海英骏生物技术公司合成。

1.2苹果MpSnRK2.4基因的克隆

采用改良CTAB-LiCl法[13]提取楸子叶片总RNA，按SYBR®PrimeScriptTMRT-PCR Kit Ⅱ反转录试剂盒说明反转录，得到的cDNA用于克隆MpSnRK2.4基因。以从NCBI数据库中下载的其他植物SnRK2s基因序列为种子序列，基于苹果基因组本地数据库进行Blastn比对，得到一致性较高的苹果基因序列，并据此设计克隆MpSnRK2.4基因全长的特异引物(F:5′-GCATTTTTCCTTTTC-GTTC-3′；R:5′-GCATGAATGTGATCAACAC-3′)。PCR反应体系(25 μL) 为：ddH2O 16.8 μL，TaqBuffer 2.5 μL，MgCl22 μL，dNTP 0.5 μL，正反向引物(F、R)各1 μL，cDNA模板1 μL，TaqDNA聚合酶0.2 μL。PCR反应程序为：95 ℃预变性8 min；94 ℃变性45 s，52 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s，38个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃结束反应。RT-PCR扩增产物通过1%琼脂糖凝胶电泳检测，回收纯化后连接到pMD19-T载体上，转化大肠杆菌感受态细胞，挑取阳性克隆，PCR检测后测序。

1.3苹果MpSnRK2.4基因序列分析

采用ExPASy 中的ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)分析苹果MpSnRK2.4编码氨基酸序列的蛋白一级结构及理化性质，采用在线软件GSDS进行gDNA基因结构分析。蛋白多序列比对使用DNAMAN软件完成。从NCBI 蛋白数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/)中下载拟南芥(Arabidopsisthaliana)、水稻(Orazasativa)、小立碗藓(Physcomitrellapatenssubsp.patens)、卷柏(Selaginellamoellendorffii)、莱茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)的SnRK2蛋白序列，利用MEGA5软件中的 MUSCLE alignment 程序与苹果MpSnRK2.4进行比对，再用邻接算法NJ(Neighbor-Joining)构建系统进化树，Bootstrap 重复设为1 000次。

1.4苹果MpSnRK2.4基因植物表达载体的构建

根据Gateway®技术说明书，利用Premier(5.0)软件设计MpSnRK2.4 Gateway引物(表1)。对于测序获得的目的基因片段，以BP反应第一轮引物和attB通用引物(attB1、attB2)经过2次PCR获得带有attB位点的基因片段。反应体系和反应程序同1.2节基因克隆，具体操作时根据不同的引物更改退火温度即可。纯化回收PCR产物，按照说明书进行BP反应；反应体系(5 μL)包括纯化产物(100 ng)、pDonr 222载体(40 ng)、BP反应酶(1 μL)和双蒸水；反应产物转化大肠杆菌Top10感受态细胞，挑取阳性克隆测序，提取质粒(entryclone)。再进行LR反应，反应体系(5 μL)包括entryclone(50 ng)、pGWB411(50 ng)、 LR反应酶(1 μL)和双蒸水；反应产物转化大肠杆菌Top10感受态细胞，挑取阳性克隆测序，提取重组质粒；将重组质粒用冻融法转化农杆菌EHA105。

表 1　苹果MpSnRK2.4 基因表达载体构建所用Gateway引物

1.5苹果MpSnRK2.4基因的转化

Micro-Tom转化参见Sun等[14]的方法。将转基因组培苗培养于组培室中，温度22～26 ℃，光照时长16 h，光照强度30～40 μmol/(m2·s)。

1.6转基因番茄的鉴定

选取生根形态正常的转基因番茄株系，按照百泰克公司多糖多酚植物总RNA快速提取试剂盒(离心柱型)说明，采集叶片进行RNA提取，反转录后以cDNA为模板进行PCR扩增。以农杆菌菌液为阳性对照，未处理的Micro-Tom DNA 为阴性对照，通过电泳检测，初步鉴定出阳性株系。定量PCR引物为F:5′-ATATGCGAGGCAAGGACAC-3′，R:5′-CCTGAAAAGCCACAACTGAC-3′。番茄内参基因为Lat1和Lat2(5′-AGACCACGAGA-ACGATATTTGC-3′，5′-TTCTTGCCTTTTCAT-ATCCAGACA-3′)。qRT-PCR反应体系(20 μL)为：SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(2×)10 μL，ddH2O 8.2 μL，cDNA 1 μL，正反向引物各0.4 μL。反应程序为：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性30 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，40个循环。用 2-ΔΔCT法[15]计算MpSnRK2.4基因在不同株系中的相对表达量。

2结果与分析

2.1苹果MpSnRK2.4基因的克隆与序列分析

楸子叶片cDNA经 RT-PCR扩增后得到了长为1 220 bp的片段(图1)。通过分析发现该基因中含有一个长1 026 bp的完整开放阅读框(ORF)，编码341个氨基酸，与苹果基因组中的MDP0000168341序列高度相似(图2)。

图 1　苹果MpSnRK2.4基因的PCR克隆M.D2000 Marker；1.目的片段

ProtParam分析表明，苹果MpSnRK2.4序列编码的341个氨基酸残基中，带负电荷的氨基酸(天冬氨酸Asp和谷氨酸Glu)有52 个，带正电荷的氨基酸(精氨酸Arg和赖氨酸Lys)有48个。预测其编码的蛋白质分子质量为38.475 ku，理论等电点(pI)为6.06。

图 2　苹果MpSnRK2.4基因序列的ORF全长黑框表示与苹果基因组MDP0000168341序列相同；灰框表示不同的碱基；Consensus为相同碱基序列

蛋白质序列相似性比对分析发现，苹果MpSnRK2.4所编码的蛋白与已报道的SnRK2蛋白家族成员有较高的同源性，具有保守的ATP结合结构域和丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶结构域，其中与水稻OsSAPK3的蛋白序列相似度最高(73.9%)(图3)。

为检测MpSnRK2.4与其他植物中SnRK2蛋白的亲缘关系，本研究选取10个拟南芥SnRK2蛋白全长序列、10个水稻SAPKs蛋白全长序列、4个小立碗藓PHDYPARFTs蛋白全长序列、6个卷柏SMOSTs蛋白全长序列及4个莱茵衣藻SnRKs蛋白全长序列进行系统进化树分析，结果(图4)表明，藻类SnRK2蛋白与其他物种差异较大，其他5个物种SnRK2s家族基因编码蛋白可分为3个亚组，其中MpSnRK2.4与拟南芥中的AtSnRK2.7、AtSnRK2.8以及水稻中的OsSAPK1、OsSAPK2、OsSAPK3同属一个亚族，且与OsSAPK3的亲缘关系最近。

2.2苹果MpSnRK2.4基因gDNA结构分析

利用在线软件GSDS对苹果MpSnRK2.4进行基因结构分析，结果(图5)表明，MpSnRK2.4基因gDNA全长序列为3 101 bp，包含9个外显子(Exon)和8个内含子(Intron)。

2.3苹果MpSnRK2.4基因植物表达载体的构建

构建的MpSnRK2.4植物表达载体Gateway pGWB411中带有Flag标签和选择标记基因NptⅡ(图6)。

2.3.1LR反应菌液鉴定选取获得的大肠杆菌单菌落进行菌液PCR，引物为attB通用引物，得到与MpSnRK2.4基因大小相等的目的条带(1 026 bp)(图7)，证明已经成功构建了含有MpSnRK2.4基因的植物表达载体，命名为pGWB411-SnRK2.4。

2.3.2转化农杆菌菌液检测将植物表达载体pGWB411-SnRK2.4转入农杆菌EHA105感受态细胞中，用克隆引物进行PCR检查，也观察到目的条带(图8)，表明植物表达载体已经转入农杆菌中，可以用来进行后续的转化试验。

2.4苹果MpSnRK2.4基因的转化

2.4.1抗性植株的获得经消毒的Micro-Tom番茄种子见光1周左右可获得无菌苗(图9A)。子叶叶段经预培养、侵染、共培养、洗菌后放入筛选培养基中，见光后获得抗性再生芽(图9B)。再生芽经几次更换筛选培养基后长至2～3 cm(图9C)，放入生根培养基中暗培养3 d，见光第5天开始生根，见光2周后挑选根系发育正常的组培苗检测、移栽，获得转MpSnRK2.4的番茄植株21株(图9D)。

2.4.2转基因植株的PCR检测对21个转基因番茄株系和阴性对照、阳性对照番茄基因组RNA反转录后进行PCR检测发现，21个株系中有10个株系(编号分别为1，6，7，9，12，13，15，17，18，19)及阳性对照均扩增出与目标条带大小一致的特异条带，而假阳性株系和阴性对照番茄中未出现条带(图10)，初步表明目的基因已经转入番茄中。

图 3　苹果MpSnRK2.4与其他植物SnRK2s蛋白的氨基酸序列比对

图 4　苹果MpSnRK2.4与其他植物SnRK2s蛋白序列的系统进化树分析MpSnRK2.4为本研究所获序列、OsSAPKs(1～10)为水稻SnRK2序列、AtSnRKs(2.1～2.10)为拟南芥SnRK2序列、PHYPADRAFTs为小立碗藓SnRK2序列、SMOSTs为卷柏SnRK2序列、CrSnRKs为莱茵衣藻SnRK2序列

图 5　苹果MpSnRK2.4基因的gDNA结构

图 6　苹果MpSnRK2.4植物表达载体Gateway pGWB411的结构

图 7　苹果pGWB411-SnRK2.4载体的LR反应菌液检测

图 9　转MpSnRK2.4基因番茄植株的获得

图 10　转MpSnRK2.4基因番茄植株的PCR检测

2.4.3MpSnRK2.4在转基因番茄株系中的表达应用实时定量PCR技术，检测10个番茄转化株系中MpSnRK2.4基因的表达情况，结果(图11)表明，未转基因植株中MpSnRK2.4表达量很低，转基因株系中的表达量较高，尤其是株系1，其表达量约为株系13和19的4倍，是其他转基因株系的7～14倍。

图 11　MpSnRK2.4在转基因番茄株系中的表达CK.未转MpSnRK2.4基因番茄植株；1，6，7，9，12，13，15，17，18，19.转MpSnRK2.4基因番茄株系

3讨论

本研究通过RT-PCR技术，以楸子叶片RNA反转录的cDNA为模板，克隆得到了MpSnRK2.4基因，构建了该基因的植物过表达载体，并成功转化Micro-Tom番茄。

通过序列相似性比对发现，苹果MpSnRK2.4基因与其他植物中已鉴定的SnRK2家族基因有很高的一致性。藻类、苔藓、蕨类中存在较少的SnRK2基因，而种子植物拟南芥、水稻中该基因家族成员增多，表明SnRK2家族可能来源于共同的祖先，且在进化过程中家族成员的功能趋于多样化。系统发育树分析表明，苹果MpSnRK2.4与拟南芥中的AtSnRK2.7、AtSnRK2.8以及水稻中的OsSAPK1、OsSAPK2、OsSAPK3同属SnRK2蛋白家族的第Ⅱ族，此组中的成员全都来自高等植物，它们可能具有相似的生理功能。SnRK2s基因参与了不同的胁迫信号转导途径，携带非寄主抗性基因Rxo1的水稻植株受水稻白叶枯病感染后，SAPK3的表达明显上调[16]，AtSnRK2.7和AtSnRK2.8在拟南芥响应干旱胁迫信号中起重要作用[17]。这些报道为研究MpSnRK2s基因的功能提供了依据。本试验选择Gateway pGWB411载体为植物表达载体，其植物筛选抗性为卡那霉素，是因为其转化效率已在前期的转基因工作中得到证实。在构建Gateway载体的过程中，正向和反向引物添加attB位点的过程采用两步法，以确保正确添加全部25 bp的attB位点；BP和LR反应中的25 ℃恒温过程采用过夜反应方式，可充分提高反应效率，从而构建出高效、稳定的Gateway植物表达载体。

Micro-Tom作为一种模式植物，因其高转化率和70～90 d内果实成熟[18]而被广泛应用，是研究果实成分及发育相关问题的有利试验材料。本研究通过实时定量PCR对得到的转化Micro-Tom株系中MpSnRK2.4基因的表达量分析发现，株系1的表达量明显高于其他株系，证明MpSnRK2.4基因在该株系中高表达，进一步验证了转基因植株的准确性。

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Cloning and transformation ofMpSnRK2.4 gene fromMalusprunifolia

QIN Yuan，SHAO Yun，LIANG Dong，ZOU Yang-jun

(CollegeofHorticulture,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi712100,China)

Abstract:【Objective】 MpSnRK2.4 gene cloned from Malus prunifolia was transformed into Lycopersicon esculentum cultivar Micro-Tom to provide basis for understanding its functions.【Method】 The full-length ORF sequence of MpSnRK2.4 was cloned from young leaves of Malus prunifolia.The overexpression vector of pGWB411-SnRK2.4 was constructed by Gateway technique and transformed into Micro-Tom by the Agrobacterium-mediated transformation method.The transgenic lines were identified by qRT-PCR after kanamycin screening and the expression of MpSnRK2.4 was analyzed in different transgenic lines.【Result】 A sequence of 1 220 bp was cloned for MpSnRK2.4 gene.This sequence contained a full-length of ORF sequence (1 026 bp) encoding 341 amino acids.The gDNA sequence contained 8 introns and 9 extons,the predict molecular weight was 38.475 ku and isoelectric point was 6.06.Phylogenetic tree indicated that MpSnRK2.4 was most homologous with Oryza sativa OsSAPK3 and amino acid sequence alignment showed that MpSnRK2.4 was highly homologous with other known SnRK2s protein sequences.PCR test indicted that MpSnRK2.4 expressed in tomato successfully and qRT-PCR showed that MpSnRK2.4 expressed differently in transgenic lines with the highest expression in line 1.【Conclusion】 MpSnRK2.4 gene was cloned and 10 transgenic Micro-Tom lines were obtained.

Key words:Malus prunifolia;SnRK2;gene clone;transgene

DOI：网络出版时间:2016-01-0810:2210.13207/j.cnki.jnwafu.2016.02.015

[收稿日期]2014-06-30

[基金项目]“十二五”国家科技计划项目“早中熟优质多抗苹果、梨新品种、砧木选育研究”(2013BAD02B01-2)

[作者简介]秦源(1989-)，女，山东日照人，硕士，主要从事果树生物技术研究。E-mail:gougouqy@163.com[通信作者]邹养军(1969-)，男，陕西乾县人，副教授，博士，主要从事旱地苹果栽培技术的研究与推广。

[中图分类号]S661.1

[文献标志码]A

[文章编号]1671-9387(2016)02-0105-08

E-mail:yangjunzou@126.com