细粒棘球蚴RTN4基因的克隆及序列分析

刘田莉，孟庆玲，乔　军，陈　诚，马　玉，胡政香，才学鹏，陈创夫

(1 石河子大学 动物科技学院，新疆 石河子 832003；2 中国农业科学院 兰州兽医研究所，甘肃 兰州 730046)



细粒棘球蚴RTN4基因的克隆及序列分析

刘田莉1，孟庆玲1，乔军1，陈诚1，马玉1，胡政香1，才学鹏2，陈创夫1

(1 石河子大学 动物科技学院，新疆 石河子 832003；2 中国农业科学院 兰州兽医研究所，甘肃 兰州 730046)

[摘要]【目的】 克隆细粒棘球蚴(Eg)内质网膜蛋白4(Reticulon-4，RTN4)抗原基因，对其序列进行生物信息学分析。【方法】 采集感染Eg的绵羊肝脏和肺脏，提取Eg头节总RNA为模板，对RTN4基因进行RT-PCR扩增，将PCR产物克隆到pMD19-T载体后测序，对其核苷酸序列及氨基酸序列进行生物信息学分析。【结果】 Eg RTN4 cDNA全长654 bp，编码217个氨基酸，蛋白质分子质量为25.3 ku，等电点为8.83。编码氨基酸序列中含有1个N端酰基化位点、2个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点和4个蛋白激酶C磷酸化位点。经生物信息学软件预测，RTN4蛋白的抗原表位区主要集中在第1-47位、第71-147位和第171-217位区域；含有2个高度疏水区，2个跨膜区，膜外区分别位于第1-47位和第171-217位。【结论】 成功克隆了Eg RTN4基因，预测了其编码蛋白抗原的结构和表位。

[关键词]细粒棘球蚴；抗原基因；基因克隆；生物信息学分析

细粒棘球蚴病(Echinococcosis)是由中绦期细粒棘球蚴(Echinococcusgranulosus,Eg)寄生于人和其他中间宿主的肝、肺、腹腔等内脏器官形成机械性压迫，造成不同程度的组织损伤和功能障碍，同时可导致过敏反应引起死亡的一种人畜共患寄生虫病[1-4]。由幼虫棘球蚴引起的棘球蚴病，又称为包虫病，呈世界性分布。我国是包虫病发病率较高的国家之一。据1999年全国包虫病防治研讨会统计资料，我国现有50万包虫病例，仅新疆平均每年需手术治疗的病例就在2 000例以上，可见包虫病严重危害着我国西部农牧民的健康。因此，研发有效的包虫病诊断试剂和疫苗一直是包虫病防控研究的热点[5-7]。

筛选具有免疫原性的抗原蛋白是研发Eg重组免疫诊断试剂和亚单位疫苗的前提[8-12]。Eg的许多抗原基因可在六钩蚴阶段高效表达，如蛋白酶抑制剂基因、四跨膜蛋白(Tetraspanin,TSPAN)基因、内质网膜蛋白(Reticulon,RTN)基因等，这些基因是重组免疫诊断抗原和亚单位疫苗研发的候选基因。人们在哺乳动物中发现了4个RTN亚蛋白家族：RTN1、RTN2、RTN3和RTN4，并在真核生物中发现了至少250个RTN样蛋白[13]。随着对RTN家族同源基因研究的深入，研究人员发现其家族基因在骨骼肌、外周血白细胞、小肠、结肠等组织中都有表达，特别是RTN3和RTN4可表达于机体的各个组织，且不同的RTN4具有不同的生物学功能[14-15]。本研究根据已经报道的Eg全基因组序列，设计特异性引物，通过RT-PCR技术对EgRTN4抗原基因进行扩增、克隆和测序，通过分子生物学软件对其核苷酸及编码的氨基酸序列进行生物信息学分析，以期为Eg重组免疫诊断抗原和亚单位疫苗的研发奠定基础。

1材料与方法

1.1材料

绵羊Eg病料组织(肝脏和肺脏)采自新疆沙湾县屠宰场，病料取回后立即冻存于-80 ℃冰箱。大肠杆菌(E.coli)菌株DH5α、PCR反应试剂、pMD19-T载体和DNA Marker购自TaKaRa公司；质粒小量提取试剂盒和DNA凝胶回收试剂盒购自诺维森(北京)生物科技有限公司；RNA pure Tissue Kit和SuperRT cDNA Kit购自北京康为世纪生物科技有限公司。

1.2总RNA的提取

从Eg感染绵羊的肝脏和肺脏抽取Eg囊液于1.5 mL的EP管中，12 000 r/min离心10 min，收集上清液于-20 ℃保存，将含有原头蚴的沉淀用北京康为世纪生物科技有限公司的RNA pure Tissue Kit提取总RNA，并用SuperRT cDNA Kit反转录成cDNA，置-20 ℃保存备用。

1.3引物的设计与合成

根据GenBank中发表的相关绵羊EgRTN4基因序列(GenBank登录号：EG_04657)，采用Premier 5.0引物软件设计特异性引物。上游引物p1：5′-ATGGCGTCTGATACTGTTGCG-3′，下游引物p2：5′-CTAGTTTTGCTTTTCCTTTTTAAG-3′。引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。

1.4EgRTN4的RT-PCR扩增及克隆

PCR反应体系50 μL：cDNA模板2 μL，10×PCR Buffer 5 μL，2.5 mmol/L dNTPs 4 μL，上游引物(25 μmol/L)、下游引物(25 μmol/L)各1 μL，ddH2O 36.8 μL，TaqDNA聚合酶(5 U/μL) 0.2 μL。反应条件为：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性40 s，58 ℃退火40 s，72 ℃延伸50 s，30个循环；72 ℃延伸10 min。将 RT-PCR产物在1.0%的琼脂糖凝胶上电泳，对扩增得到的PCR产物进行纯化回收，并与载体pMD19-T连接，转化入E.coliDH5α感受态细胞，最后进行PCR验证。将验证正确的重组载体产物送至生工生物工程(上海)有限公司测序。

1.5EgRTN4基因编码氨基酸序列及生物信息学分析

用DNAMAN软件确定基因cDNA的开放阅读框序列，对GenBank中发表的EgRTN相关序列进行分析，并推导编码蛋白质的氨基酸序列。用ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)计算蛋白质的理论分子质量、理论等电点。通过MotifScan(http://myhits.isb-sib.ch/cgi-bin/motif_scan)预测蛋白的糖基化、磷酸化等修饰位点；通过Protscale(http://web.expasy.org/protscale/)分析蛋白质的亲水性与疏水性；采用TMHMM Server v.2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)进行结构域预测；通过SignalP(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)进行蛋白质的信号肽预测。通过SOPMA(http://sopma. expasy.org/)和SWISS-MODEL(http://swissmodel. expasy.org/)对蛋白质的二级、三级结构进行预测。采用DNAStar (Jameson Wolf方法)对蛋白的抗原表位进行预测。

2结果与分析

2.1EgRTN4基因的克隆

利用特异性引物扩增EgRTN4基因序列，经1.0 %的琼脂糖凝胶电泳检测，所扩增的目的RT-PCR产物长度约为654 bp(图1)。转化后，随机挑取单菌落，做菌液PCR筛选验证，结果表明成功得到了阳性转化子。

图 1　Eg RTN4基因的RT-PCR扩增

2.2EgRTN4基因核苷酸及其编码氨基酸序列分析

经测序，EgRTN4 cDNA全长654 bp，编码217个氨基酸。Eg RTN4蛋白分子质量为25.3 ku，等电点理论值为8.83，含有1个N端酰基化位点、2个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点和4个蛋白激酶C磷酸化位点(图2)。利用网上在线工具预测Eg RTN4蛋白的疏水性，结果(图3)发现其疏水性最大值为3.000，最小值为-3.000，含有2个较高的疏水区，推测其含有2个跨膜区，从疏水性/亲水性总体来看，该蛋白疏水性区域明显大于亲水性区域。

2.3Eg RTN4蛋白的生物信息学分析

2.3.1跨膜区预测将EgRTN4编码的氨基酸序列与NCBI上所公布的其他分离株RTN4序列进行BLAST比对，筛选出同源性较高的Eg国外分离株RTN4(CDJ23569.1)和Eg绵羊分离株RTN4 (EUB60463.1)。利用在线软件对本研究Eg RTN4蛋白的跨膜区进行预测，并与上述2株的氨基酸序列跨膜区进行比较。结果发现，本研究Eg RTN4具有2个跨膜区，而RTN4(CDJ23569.1)有3个跨膜区，RTN4(EUB60463.1)有1个跨膜区(图4)。对膜外区氨基酸的比较结果(图5)发现，这3种蛋白具有较高的同源性，说明本研究Eg RTN4蛋白具有保守的膜外区

图 2　Eg RTN4 cDNA核苷酸序列及其推导的氨基酸序列

2.3.2信号肽预测运用在线软件对Eg RTN4进行信号肽预测，结果显示，其C、S、Y值均不高于阈值(C为信号肽切点计分，S为信号肽位置计分，Y为综合计分)，表明在Eg RTN4中没有明显的信号肽。

2.3.3二级及三级结构预测通过在线软件预测，Eg RTN4蛋白的二级结构中有α-螺旋(69.12%)、延伸链(5.99%)、β-转角(1.84%)、无规则卷曲(23.04%)，无β-折叠片。由此可知，该蛋白质二级结构主要以α-螺旋、无规则卷曲为主(图6-A)。三级结构预测结果(图6-B)显示，该蛋白含有4个α-螺旋、12个延伸链和3个β-转角。

2.3.4抗原表位预测利用DNAStar软件对Eg RTN4氨基酸序列进行抗原表位预测分析，结果(图7)显示，Eg RTN4的抗原表位区主要集中于3个区域，分别是第1-47位、第71-147位和第171-217位。

2.4Eg RTN4与其他绦虫RTN4氨基酸序列的同源性比较

将Eg RTN4编码氨基酸序列在NCBI中进行blastp检索，结果(图8)显示，Eg RTN4氨基酸序列与Eg国外分离株RTN4(CDJ23569.1)的同源性高达99%，与Eg绵羊分离株RTN4(EUB60463.1)的同源性为83%。

图 3　Eg RTN4蛋白的疏水性分析

图 4　Eg RTN4蛋白的跨膜区分析

图 5　本研究Eg RTN4与RTN4(CDJ23569.1)和RTN4(EUB60463.1)蛋白膜外区氨基酸的比较

图 6　Eg RTN4蛋白的二级结构(A)和三级结构(B)

图 7　Eg RTN4蛋白的抗原表位

图 8　Eg RTN4与其他分离株氨基酸序列的同源性比较

3讨论

RTN家族广泛存在于动物、植物和真菌等真核生物中，最初研究发现，RTN蛋白是神经内分泌细胞的特异性蛋白(Neuroendocrine-specific protein,NSP)[14]，可作为神经内分泌细胞分化的标记，主要定位于细胞内质网中，但是对于RTN家族蛋白在寄生虫方面的生物学功能还不是很清楚。有研究表明，RTN家族产生于真核生物进化早期的内膜系统建立阶段，由早期富含内含子的reticulon祖先衍化而来[15-16]。有研究发现，寄生虫的RTN在寄生虫逃避和调控宿主免疫应答方面发挥着重要作用[12]。

研发新型诊断试剂和疫苗来预防控制我国牧区细粒棘球蚴病的流行具有重要的现实意义[17-20]。目前，RTN被认为是重组免疫诊断抗原和亚单位疫苗研发的候选基因。本研究从Eg原头蚴中提取总RNA，通过RT-PCR技术获得了RTN4的cDNA序列。利用生物信息学软件对其编码氨基酸序列进行了分析，结果发现，Eg RTN4含有2个较高的疏水区和2个跨膜区，这与利用蛋白质的亲疏水性序列推测的跨膜结构一致。通过对Eg RTN4膜外区氨基酸进行分析比较发现，本研究Eg RTN4与Eg国外分离株RTN4(CDJ23569.1)和Eg绵羊分离株RTN4(EUB60463.1)的膜外区氨基酸序列具有较高的同源性，推测Eg RTN4具有保守的膜外区。

本试验克隆了EgRTN4抗原基因的cDNA序列，对其编码氨基酸序列重要功能位点进行分析发现，Eg RTN4含有1个N端酰基化位点、2个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点和4个蛋白激酶C磷酸化位点。其抗原表位区主要集中在3个区域，分别位于第1-47位、第71-147位和第171-217位。且膜外区是抗原表位集中区，说明Eg RTN4膜外区是高度保守的蛋白。

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Cloning and sequence analysis ofRTN4 gene ofEchinococcusgranulosus

LIU Tian-li1,MENG Qing-ling1,QIAO Jun1,CHEN Cheng1,MA Yu1,HU Zheng-xiang1,CAI Xue-peng2,CHEN Chuang-fu1

(1DepartmentofAnimalScienceAndTechnology,ShiheziUniversity,Shihezi,Xinjiang832003,China;2LanzhouVeterinaryResearchInstitute,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Lanzhou,Gansu730046,China)

Abstract:【Objective】 This study aimed to clone and carry out bioinformatics analysis on the sequence of an important antigen gene reticulon-4 (RTN4) gene of Echinococcus granulosus.【Method】 The total RNA was extracted by hydatid protoscolex from sheep liver and lung infected with Echinococcus granulosus.The open reading frame (ORF) sequence of RTN4 was then amplified by RT-PCR before being cloned into pMD19-T vector for bioinformation analysis of nucleotide sequence and coding sequence of amino acids.【Result】 The full cDNA of RTN4 gene contained 654 bp,encoding 217 amino acids.It had a molecular weight of 25.3 ku and the isoelectric point was 8.83.The coding sequence of amino acids had one N-acylation site,two casein kinase Ⅱ phosphorylation sites and four protein kinase C phosphorylation sites.The results of bioinformatics software prediction showed that RTN4 protein mainly had three parts of 1 to 47,71 to 147,and 171 to 217 with two highly hydrophobic regions and two transmembrane domains.The extracellular domains were at 1 to 47 and 171 to 217.【Conclusion】 The RTN4 gene of Eg was successfully cloned and the structure and antigen epitopes of its coding protein were predicted.

Key words:Echinococcus granulosus;antigen gene;gene cloning;bioinformatics analysis

DOI：网络出版时间:2016-02-0209:3710.13207/j.cnki.jnwafu.2016.03.003

[收稿日期]2014-08-07

[基金项目]国家公益性(农业)行业专项(201303037)；国家国际科技合作项目(2014DFR31310)；新疆自治区研究生科研创新项目(XJGRI2014059)

[作者简介]刘田莉(1992-)，女，河南商丘人，在读硕士，主要从事动物寄生虫研究。E-mail:liutianli910903@sina.com[通信作者]孟庆玲(1969-)，女，江苏徐州人，教授，博士，主要从事寄生虫分子生物学研究。E-mail:xjmqlqj@163.com

[中图分类号]S852.73+4

[文献标志码]A

[文章编号]1671-9387(2016)03-0017-06