滁菊茶汤中黄酮类化合物稳定性研究

倪良旭，孙艳辉，苗文娟

滁菊茶汤中黄酮类化合物稳定性研究

倪良旭，孙艳辉，苗文娟

摘要:利用紫外可见分光光度法研究了光照、氧气、温度、金属离子、pH等因素对滁菊茶汤中黄酮类化合物稳定性的影响。结果表明光照、氧气、温度、金属离子、pH和食品添加剂等对滁菊黄酮的稳定性均有不同程度的影响，在过酸过碱的环境中滁菊黄酮均易受到破坏，在pH=6附近其稳定性最佳；光照和氧气的存在均会降低滁菊黄酮稳定性；滁菊黄酮随温度的升高及保温时间的延长，其稳定性均降低；金属离子中Na+、K+和Mg2+的存在对滁菊黄酮稳定性无影响，而Cu2+、Fe3+和Al3+和Ca2+对滁菊黄酮稳定性及色泽影响较大；柠檬酸、葡萄糖和蔗糖等食品添加剂均对滁菊中黄酮类化合物的稳定性构成不同程度的影响。

关键词:滁菊；茶汤；黄酮；稳定性

滁菊(Chuju Chrysanthemum morifolium) 俗称甘菊、白菊，是滁州市传统地方特产，安徽省四大著名道地药材之一，被授予中国名牌农产品、地理标志产品称号[1]。滁菊主要成分有黄酮类、挥发油类、氨基酸类和微量元素类等有效成分[2-3]。与其他菊花相比，其黄酮、挥发油、硒等含量均超过其它菊花，其中黄酮含量高32%--61%[3]，为药、饮两用之佳品。

滁菊花蕊金黄硕大，花瓣晶莹玉白，茶汤清澈黄亮[4]，但滁菊茶汤静置一段时间后易出现变色现象，极大限制了滁菊的进一步工业化应用。推测滁菊茶汤中主要呈色物质为黄酮类化合物，关于不同原料中黄酮类物质的稳定性研究较多[5-7]，关于滁菊，仅张启勇[8]研究了光照和温度对滁菊95%乙醇浸提液中黄酮的稳定性，未有其他研究者关注过滁菊中黄酮类物质的稳定性。

本研究以滁菊茶汤中的总黄酮含量变化为分析指标，分别研究了光照、氧气、温度、金属离子、pH、以及甜味调节剂、氧化还原剂、防腐剂等因素对其稳定性的影响，以期为滁菊茶饮料的开发提供一定的理论参考。

1材料与方法

1.1材料与设备

滁菊：由滁菊研究所提供；芦丁，分析标准品，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、过氧化氢、柠檬酸等均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。

UV-1801型紫外可见分光光度计(北京瑞利分析仪器有限公司)、HH-4型数显恒温水浴锅(金坛市杰瑞尔电器有限公司)、JA5003J型电子天平(上海越平科学仪器有限公司)、PHS-3C型酸度计(上海雷磁仪器厂)、SHZ-D(Ⅲ)循环水式真空泵(巩义市予华仪器有限公司、DHG-9101-OSA型电热恒温鼓风干燥箱(上海三发科学仪器有限公司)。

1.2实验方法

1.2.1滁菊茶汤的制备

称取4.0g滁菊，溶于70℃的蒸馏水，体积比为1:50，在70℃条件下恒温浸提20min，过滤，弃滤渣，滤液冷却至室温，即得滁菊茶汤。

1.2.2芦丁标准曲线的制定

精密称取芦丁标准品3.0mg，置10mL容量瓶中，用60%乙醇超声溶解并定容至刻度，摇匀，配制成浓度为0.30mg/mL 的芦丁标准溶液。分别称取标准溶液0.5，1.0，1.5，2.0，2.5mL，置于10mL容量瓶中，分别加入60%乙醇2.4mL，摇匀；再加入5%亚硝酸钠0.4mL，摇匀，静置 6min；分别加入10%硝酸铝0.4mL，摇匀，静置 6min；分别加入4%氢氧化钠4mL，摇匀，最后加入60%乙醇定容至刻度，静置 15min。以相应试剂为空白，在508nm处测定吸光度[9]。

1.2.3滁菊黄酮含量的测定

测定方法同1.2.2。

1.2.4不同因素对滁菊黄酮稳定性的影响

(1) pH对滁菊黄酮稳定性的影响

按照步骤1.2.1制备茶汤，分别量取50mL制备好的滁菊茶汤置于8个小烧杯中，依次编号，用醋酸和碳酸钠调节滁菊茶汤pH值至3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，立即进行黄酮含量的测定，在2h后再次进行黄酮含量的测定，比较分析pH值变化对滁菊黄酮稳定性的影响。

(2)光照和氧气对滁菊黄酮稳定性的影响

按照步骤1.2.1制备茶汤，分别量取50mL茶汤置于4个小烧杯中，依次编号，分别置于光照有氧、光照无氧、黑暗有氧、黑暗无氧条件下，每隔1.5h量取1mL溶液，测定其黄酮含量变化。

(3)温度对滁菊黄酮稳定性的影响

按照步骤1.2.1制备茶汤，量取等量茶汤于试管中，分别置于60℃、70℃、80℃、90℃的恒温水浴锅中静置水浴，每隔2h测黄酮含量，以室温下茶汤的黄酮含量为对照进行对比分析。

(4)金属离子对滁菊黄酮稳定性的影响

研究Na+、K+、Mg2+、Ca2+、Cu2+、Al3+和Fe3+对滁菊黄酮稳定性的影响，使用超纯水配制0.2mol/L的NaCl、KCl、MgCl2、CaCl2和AlCl3溶液，以及0.02mol/LCuCl2和0.01mol/L FeCl3溶液。

同时，采用超纯水制备滁菊黄酮茶汤，制备方法同1.2.1。取6只试管，分别加入上述各种金属离子溶液 0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mL，再向各试管中加入5mL滁菊茶汤，摇匀后静置5min，进行滁菊黄酮含量的测定。

(5)氧化剂H2O2和柠檬酸对滁菊黄酮稳定性的影响

在滁菊茶汤中分别添加浓度为0.5%、1.0%、1.5%、2.0%的过氧化氢溶液和柠檬酸溶液，摇匀，测定其黄酮含量变化。

(6)甜味调节剂(葡萄糖和蔗糖)对茶汤中黄酮类物质稳定性的影响

在滁菊茶汤中分别添加浓度为1%、5%、10%、15%、20%的葡萄糖和蔗糖溶液，摇匀，测定其黄酮含量变化。

(7)还原剂Na2SO3和防腐剂山梨酸钾对黄酮稳定性的影响

在滁菊茶汤中分别添加浓度为0.01%-0.05%的Na2SO3溶液和0.01%-0.06%的山梨酸钾溶液，摇匀，测定其黄酮含量变化。

1.3数据分析

采用Excel软件对所得数据进行分析并作图，所有数据均重复测定3次，数据采用均值±标准误差表示。

2结果与分析

2.1滁菊茶汤中初始黄酮含量的测定

图1芦丁标准曲线

依照1.2.2所述方法，测定芦丁标品的吸光度，得回归方程：y=0.7847x+0.0389(R2=0.9974)，说明黄酮含量与吸光度线性关系良好。滁菊茶汤的吸光度为0.466±0.003，根据标准曲线，求得滁菊茶汤中黄酮含量为0.5546±0.0086mg/mL，为表示方便，下文均以吸光度的变化来表示滁菊黄酮含量的变化。

2.2pH对黄酮稳定性的影响

由图2可见，在pH 3-10范围内，滁菊茶汤的吸光值随pH的增加先升高后降低，在pH 6附近有最大吸光值，说明此时的滁菊黄酮含量最高，且在pH=6测得的吸光值接近滁菊茶汤原液(滁菊茶汤原液pH 5.84)的吸光值。由图2的趋势线可知，在强酸性和强碱性条件下，滁菊黄酮稳定性较差，说明滁菊茶汤中黄酮类化合物在酸碱性较强的环境中容易受到破坏，表现出不稳定性。其次，由图2中0h与2h后的茶汤吸光值的对比可知，不同pH值下的茶汤中的黄酮含量随时间无太大变化，可以认为在短时间内黄酮的稳定性良好。

图2不同pH下滁菊黄酮稳定性

2.3光照和氧气对黄酮稳定性的影响

相关研究表明，绿茶汤色极易受到光照、温度、湿度和氧气等因素影响而发生劣变，从而对绿茶的品质带来不良影响[10]。同时，有相关研究报道，光照可影响夏枯草、苦荞等黄酮类化合物的稳定性[11-12]，张启勇[8]也表明在光照条件下，滁菊中总黄酮在4天内降解了34.85%，可见在光照下黄酮降解较为明显。但目前尚无研究者综合考虑光照和氧气这两个因素对滁菊黄酮稳定性的综合影响。这里以滁菊黄酮含量变化为指标，来考察光照和氧气对滁菊汤色稳定性的影响。

图3光照和氧气对滁菊黄酮稳定性的影响

由图3可见，除黑暗无氧条件外，其他条件下滁菊水提物的吸光值均随处理时间的增加而下降，其中，光照有氧处理后滁菊吸光值随处理时间的增加下降最快，而黑暗无氧处理后滁菊吸光值较稳定，说明光照和氧气这两个因素对滁菊黄酮的稳定性均有不利影响。由图3进一步可见，在相同处理时间下，Abs黑暗无氧>Abs光照无氧>Abs黑暗有氧>Abs光照有氧，说明氧气对黄酮的降解作用大于光照。因此在滁菊饮料的生产实践中，应尽可能在避光条件进行加工，同时，在包装和贮藏过程中，需保证无氧环境，例如采用充氮保鲜技术，才能更好保证产品的质量。

2.4温度对黄酮稳定性的影响

图4温度对滁菊黄酮稳定性的影响

由图4可以看出，在不同温度下，滁菊茶汤都是随着时间的延长，黄酮含量逐渐减少，只是下降的趋势不同。其中，在室温和60℃的条件下，黄酮含量变化不明显，但是随着温度的增加，黄酮含量下降率逐渐增加，尤其是在90℃时表现的最为明显。因此可以认为，制备茶汤时，温度越高，黄酮稳定性越差，不宜在高温下摆放过长时间。

2.5金属离子对黄酮稳定性的影响

研究了不同离子对滁菊茶汤中黄酮稳定性的影响，由表1可以看出，向茶汤中加入不同浓度Na+、K+和Mg2+后，吸光值有小幅度波动，但对滁菊黄酮稳定性无显著性影响。而向茶汤中加入0.2mL Al3+，滁菊黄酮的吸光度和对照组有显著性差异(p<0.05)，但是随着Al3+浓度的增加，吸光度变化差异不显著。对于Cu2+和Ca2+，在加入0.5mL后，其吸光度才和对照组有显著性差异。加入Fe3+后，吸光度会随着离子浓度的增加而明显减小，吸光值变化显著。

表1　不同金属离子对滁菊黄酮稳定性的影响

注：1.因不同金属离子初始浓度不同，这里以添加体积来表示不同离子的浓度。

2.同行肩标不同字母符号者表示有差异显著(P<0.05)，含相同字母表示差异不显著(P>0.05)。

由表2可见，加入一定量的Na+、K+、Mg2+、Ca2+后，茶汤颜色无明显变化，加入Cu2+、Al3+和Fe3+会使茶汤颜色发生明显变化。其中，加入少量Cu2+后，黄酮溶液由浅黄色变为暗黄绿色；Al3+与滁菊黄酮反应，溶液变为亮黄色，这一点与绿茶饮料相似[13]，微量Fe3+使茶汤由浅黄色变为黄黑色。变色的原因猜测可能是黄酮中的邻二羟基与金属离子如Cu2+、Al3+和Fe3+络合显色，形成有色配位物。

表2　不同金属离子对滁菊茶汤色泽的影响

综上，滁菊黄酮的稳定性会随着金属离子浓度的改变而改变，其中Na+、K+和Mg2+对滁菊黄酮稳定性无影响，而Cu2+、Fe3+和Al3+和Ca2+对滁菊黄酮稳定性及色泽影响较大，需避免混入。

2.6氧化剂H2O2和柠檬酸对黄酮稳定性的影响

按照新国标GB2760-2014的规定，食品级的双氧水可在各类食品加工过程中作为加工助剂使用，且残留量不需限定。食品级双氧水在食品、果蔬及饮料的生产过程中，能起到消毒、杀菌、漂白等作用。这里考察了2%以内的双氧水的含量对滁菊茶汤稳定性的影响。由图5可见，随双氧水浓度的增加，滁菊黄酮吸光值对黄酮的稳定性有非常大的影响，表明双氧水对茶汤中的黄酮具有破坏作用，这与李超等人的研究结果一致[14]。

柠檬酸既可作为饮料、果汁、果酒等的酸味调节剂，同时也是饮料、果汁、果酒等的抗氧化增效剂、护色剂。GB 2760-2011对饮料中柠檬酸含量不作限制，依据口味适当添加。由图5可见，柠檬酸的添加量对黄酮的稳定性具有较大影响，柠檬酸浓度在0.5%-2.0%范围内，均可使茶汤的吸光值降低，使黄酮的稳定性降低。因此在滁菊茶汤饮料加工过程中，应避免与H2O2等氧化剂接触，同时在保证滁菊茶汤口味良好的基础上，控制柠檬酸的加入量，保证黄酮的稳定性良好。

2.7甜味调节剂(葡萄糖和蔗糖)对茶汤中黄酮类物质稳定性的影响

图5pO2和柠檬酸对滁菊茶汤稳定性的影响

图6葡萄糖和蔗糖对茶汤稳定性的影响

考察了1%-20%的糖浓度对滁菊茶汤中黄酮类物质稳定性影响，由图6可以看出，随糖浓度增加，葡萄糖和蔗糖对滁菊黄酮稳定性均有一定影响，其中，葡萄糖对滁菊黄酮稳定性影响较蔗糖显著。同时，当蔗糖浓度较低(0%-5%)时，黄酮吸光度变化甚微，黄酮的稳定性良好，因此在生产滁菊茶汤饮料时，为了调节其甜度，可以选择蔗糖作为调节剂，但是不可过量添加，避免黄酮类物质遭到破坏。

2.8还原剂Na2SO3和防腐剂山梨酸钾对黄酮稳定性的影响

依据《GB 2760-2011食品添加剂使用标准》，在食品安全使用的范围内，山梨酸钾作为防腐剂的添加量应控制在0.06%内，Na2SO3的添加量应控制在0.05%范围内。由表3可见，在向茶汤中添加了国标规定使用范围内的山梨酸钾和Na2SO3溶液后，滁菊茶汤吸光值有轻微波动。通过单因素方差分析可知，山梨酸钾在0.06%添加量范围内对滁菊茶汤吸光值无显著性影响(p>0.05)，而Na2SO3在0.02%和0.04%的添加量有显著性差异，说明低浓度的Na2SO3溶液对黄酮的稳定性无影响，而高浓度的Na2SO3溶液则会使黄酮的稳定性降低。因此在生产滁菊饮料的过程中，可适当添加少量的山梨酸钾和Na2SO3溶液，提高产品品质。

表3　山梨酸钾和Na2SO3对茶汤稳定性的影响

3结论

(1)滁菊中黄酮类化合物在酸碱性较强的环境中均易受到破坏，在pH=6附近其稳定性最佳。

(2)光照和氧气这两个因素对滁菊中黄酮类化合物的稳定性均有不利影响，氧气对黄酮的降解作用大于光照。

(3)滁菊中黄酮类化合物随温度的升高及时间的延长，其稳定性降低。

(4)滁菊中黄酮类化合物的稳定性会随着金属离子浓度的改变而改变，其中Na+、K+和Mg2+对滁菊黄酮稳定性无影响，而Cu2+、Fe3+和Al3+和Ca2+对滁菊黄酮稳定性及色泽影响较大。

(5)氧化剂(H2O2)、还原剂(Na2SO3)、酸味调节剂(柠檬酸)、甜味调节剂(葡萄糖和蔗糖)均对滁菊中黄酮类化合物的稳定性构成不同程度的影响，而防腐剂(山梨酸钾)对黄酮的稳定性则无显著性影响。

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责任编辑：王与

A Study on the stability of flavonoids in Chuzhou Chrysanthemum tea

Ni Liangxu, Sun Yanhui, Miao Wenjuan

Abstract:UV visible spectrophotometry is used to study the impact of light, oxygen, temperature, metal ion, pH etc. on the stability of flavonoids in Chuzhou chrysanthemum tea. The results show that they all have different degrees of influence on the stability of flavonoids extracted from Chuzhou chrysanthemum. Chuzhou chrysanthemum flavonoids are easy to damage in the acid or alkali environment while it is stable at pH 6. The presence of light or oxygen could reduce the stability of flavonoids of Chuzhou Chrysanthemum. The stability of Chuzhou chrysanthemum flavonoids is decreased with increasing temperature and holding time. The presence of Na+, K+ and Mg2+has no effect on the stability of flavonoids in Chrysanthemum morifolium while Cu2+, Fe3+and Al3+and Ca2+have great influence on the stability of flavonoids in Chrysanthemum morifolium. Food additives such as H2O2, Na2SO3, citric acid, glucose and sucrose have different degree of influence on the stability of the flavonoids in Chrysanthemum morifolium while there is no significant effect of potassium on the stability of flavonoids.

Key words:Chuju Chrysanthemum morifolium; tea; flavonoids; stability

中图分类号：Q946; TS201

文献标识码：A

文章编号：1673-1794(2016)02-0080-05

作者简介：倪良旭，滁州学院生物与食品工程学院；通讯作者：孙艳辉，滁州学院生物与食品工程学院教授；苗文娟，滁州学院生物与食品工程学院(安徽 滁州 239000)。

基金项目：国家级大学生创新创业训练计划项目(201310377009)；国家公益性行业(农业)科研专项(201403039)

收稿日期：2015-07-28