桑断枝烂叶病病原菌对桑树不同部位的致病性测定

陈小青，朱方容，宾荣佩，廖咏梅，韦海玲，李乙

（1.广西壮族自治区蚕业技术推广总站，南宁市 530007；2.广西大学，南宁市 530004）

桑断枝烂叶病病原菌对桑树不同部位的致病性测定

陈小青1，朱方容1，宾荣佩1，廖咏梅2，韦海玲2，李乙1

（1.广西壮族自治区蚕业技术推广总站，南宁市 530007；2.广西大学，南宁市 530004）

为测试桑断枝烂叶病病原菌对桑树的致病性，用病原菌的分生孢子、菌丝块对室内盆栽的桑树的枝叶片进行接种处理；用病原菌的菌丝块对人工气候室内水培保鲜的桑树枝梢不同部位的叶片和枝茎段进行接种处理。结果表明，在温度为20～25℃，湿度为95%～100%的条件下，接种新梢嫩叶、嫩枝，48 h就出现病斑，以后病斑不断扩大，接种后第3～5 d，病斑扩展最快；病原菌的易感染部位是桑树新梢；半年生成熟枝条和1年生老枝干难以被侵染；新梢顶端第4节位以上的嫩枝、嫩叶最容易感染发病。因此，清除病枝、病叶是减少初侵染源、防止病害发生的重要手段。

桑；断枝烂叶病；致病性

2011年3月下旬，广西的凤山、东兰、凌云、靖西等蚕区的桑园发生与流行一种新的桑病，病状表现为桑树新梢和叶片出现相似的灰褐斑而使枝条折断、病叶穿孔破烂，对蚕桑生产的危害大，文献资料查不到相似病症的记载，暂称之为“桑断枝烂叶病”。该病主要为害桑树新长的嫩枝及叶片，老枝少见染病。叶片染病，先出现灰褐色点状病斑，以后病斑扩大成圆形或不规则形病斑，病斑有同心轮纹，病斑处失去水分而干枯、变薄、易裂、穿孔、破损；枝条的病斑也为灰褐色，有的也有明显同心轮纹，病斑不断扩大，直至环绕枝条一圈，枝条病斑处干瘪、腐朽粉化、内部中空，很容易折断。2011年3-4月观察到病害在凤山县凤城、金牙、中亭、乔音、袍里等乡镇暴发流行之外，此后几年，均未大规模发生流行，仅在局部桑园发生持续为害。

本研究小组对桑断枝烂叶病进行病原菌的分离及显微镜观察，并通过分子生物学技术进行种类鉴定，初步鉴定桑断枝烂叶病由茎点霉属（Phoma）真菌引起。本文采用致病菌株对桑树枝叶不同部位的致病性进行测试，研究其侵染规律，为该病有效防控提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试病原菌菌株

FSX-FHC菌株，来源：凤山县凤城镇凤凰村发病桑园，分离保存于广西蚕业技术推广总站桑树病理实验室。

1.2 供试桑树品种

桂桑优62。

1.3 接种方法

1.3.1 分生孢子悬浮液接种盆栽桑树的叶片 采用分生孢子悬浮液对室内盆栽桑树叶片进行接种。将单孢纯化后的FSX-FHC菌株接种至桑汁培养基平板上，25 ℃黑暗条件下培养20～30 d，待培养基可观察到黑褐色分生孢子器时，用已消毒的接种针在超净工作台内挑取数个分生孢子器置于10 mL的无菌水中，用解剖针轻轻辗压分生孢子器，使分生孢子溢出，并用移液枪轻轻混打液体使分生孢子均匀地分散到无菌水中，用血球计数板测定分生孢子液的浓度，通过逐渐加入分生孢子器将溶液配制成浓度为1×108个/mL的分生孢子悬浮液。采用微型喷雾器，将配制好的分生孢子悬浮液均匀喷洒于刺伤（解剖针轻刺上表皮和叶肉）的桑叶片表面，外罩塑料薄膜保湿，置于25 ℃下36 W的白光灯光照12 h和黑暗12 h交替条件下保湿培养。3个重复，每个重复处理5株，每株喷洒分生孢子悬浮液3张叶子，喷到滴水为度。另一处理以喷洒无菌水作对照。接种3 d后观察接种叶片发病情况，并拍照记录。

1.3.2 菌丝块接种室内盆栽桑树的叶片 用FSXFHC菌株的菌丝块对室内盆栽桑树进行接种。将FSX-FHC菌株在PDA培养基上25 ℃36W的白光灯光照条件下培养7 d，自菌落边缘打直径为0.6 cm的菌碟，用解剖针挑取菌碟将菌丝面朝下接种于健康的桑叶表面，并顺势用针头轻轻刺入桑叶形成小伤口，使菌丝的表面与伤口贴合。放置于人工简易气候室内，温度23～26 ℃，每天上午10时和下午3时开雾气各0.5 h保湿培养。共接种10株，每2株为一次重复，每重复接种10个点。用无菌的PDA培养基接种作空白对照。接种3 d后观察接种叶片发病情况，并拍照记录。

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1.3.3 菌丝块接种室内水培保鲜的桑树绿枝叶 用FSX-FHC菌株的菌丝块对室内水培保鲜的桑树绿枝叶进行接种。先设定人工气候室内的温度20℃ 和湿度100%待用。选择阴天或晴天上午9时前，在田间将供试带12片叶以上的桑绿枝剪下，及时用废旧报纸包好遮光防止萎蔫，立即转入人工气候室内，置于装有灭菌水的三角瓶中水培，拉线固定好枝条梢部，防止枝条倒伏，雾化补湿，黑暗条件下放置1～2 h待枝叶完全恢复后即可接种。

将FSX-FHC菌株在PDA培养基25℃ 36 W的白光灯光照条件下培养7 d，自菌落边缘打直径为0.6 cm的菌碟，用解剖针挑取菌碟将菌丝面朝下接种于健康的桑叶表面，并顺势用针头轻轻刺入桑叶形成小伤口，使菌丝的表面与伤口贴合。

接种后，人工气候室内设定06:00～17:59温度25℃，光照强度420 Lx和18:00～05:59温度23℃ 昼夜交替，保持湿度95%以上。共接种13株，高度1 m以上，枝条带叶12片叶以上，接种部位分别在第2、4、6、8、10、12节位的叶片及其叶下茎段，每叶叶脉两侧各接1个共2个，每节茎段接1个。以无菌的PDA培养基接种作空白对照。接种3 d后观察接种叶片发病情况，并拍照记录，7 d后调查发病率。

病害分级标准为：0级，不形成病斑；1级，病斑面积占半张叶面积的1%～5%；2级，病斑面积占半张叶面积的6%～15%；3级，病斑面积占半张叶面积的16%～25%；4级，病斑面积占半张叶面积的26%～35%；5级，病斑面积占半张叶面积的35%以上。

1.3.4 菌丝块接种不同树龄枝段 剪取具有主枝段（1年生）、分枝段（半年生成熟枝段）和新梢幼嫩枝的整条树枝，共选11枝，每桑枝条按照以上分段进行接种，参照1.3.3准备接种用的FSX-FHC菌株菌丝块。接种后相对湿度95%环境保持20 d，调查发病率。

2 结果

2.1 分生孢子悬浮液接种对盆栽桑树叶片的致病性

用单孢分离纯化的FSX-FHC菌株的分生孢子器配制分生孢子悬浮液，接种于桑叶片表面。7 d后调查结果发现，每株桑苗接种的3张叶片中，对照处理仅有褐色伤痕，未见典型病斑（图1-a）；而分生孢子悬浮液接种的叶片，也只有1张发病，发病症状与田间初期症状类似，病斑中心处变薄，易失水变干破裂、穿孔，外圈为明显的淡黄色晕圈（图1-b，图1-c）。接种30 d后发病的叶片上均未观察到分生孢子器。

图1 FSX-FHC菌株分生孢子悬浮液接种盆栽桑树叶片7 d症状（a为对照；b、c为接种症状）

2.2 菌丝块接种对室内盆栽桑树叶片的致病性

与对照（见图2-a）相比，菌丝块接种桑树叶片后3 d开始出现病斑，病斑中心处初为较薄水渍状，第3～5 d病斑扩散速度最快，7 d后病斑可见明显轮纹，并有少量凸起颗粒状物，为分生孢子器，10 d以后病斑停止扩散，病斑近圆形或不规则形，病斑中间变干破裂、穿孔，外圈有明显的黄色晕圈（图2-b，图2-c），20 d后病叶开始脱落，发病症状与田间发病症状一致。从表1可以看出，以菌丝块接种发病率高达82.76%。

图2 FSX-FHC菌株菌丝块接种盆栽桑树叶片7 d症状（a为对照；b、c为接种症状）

表1 FSX-FHC菌株菌丝块接种室内盆栽桑树叶片的发病情况

2.3 菌丝块对水培保鲜绿枝不同部位叶片及其叶下茎段的致病性

用FSX-FHC菌株的菌丝块接种桑树新梢第2节至第12节的叶片及其叶下茎段，所有接种点均发病。接种后48 h即可见接种点周围出现明显水渍状，第3～4 d病斑明显扩大，但第5 d后以后病斑基本停止扩大。接种7 d后，病斑上可见明显的同心轮纹和少量的分生孢子器，但病斑组织变薄，容易破裂穿孔。其中第2节、第4节位的叶片发病率最高，叶片的发病率分别为65.38%和73.08%，茎段的发病率分别为63.64%和72.73%；第6节至第12节位的叶片、茎段的发病率均在50%以下。表明病原菌的侵染部位是新梢，第4节位以上的嫩枝、嫩叶最容易感染发病；随着枝叶的成熟，对病菌的抵抗力增强，接种后发病率降低。

图3 FSX-FHC菌株菌丝块对桑树新梢不同部位叶片及其叶下茎段的致病性

2.4 菌丝块对桑树不同年龄枝段的致病性

主枝段（1年生）、分枝段（半年生成熟枝段）和新梢幼嫩枝接种菌丝块后，1年生主枝及半年生成熟枝段未见病斑出现，发病率均为0；新梢幼嫩枝发病率为18.18%。说明成熟枝条（半年以上年龄的枝段）对病原菌有较强的抵抗性。病原菌易侵染桑树的部位为新梢未成熟幼嫩枝。

表2 FSX-FHC菌株对桑树不同年龄枝段的致病性

3 讨论

3.1 室内水培保鲜桑树新梢接种方法在病原鉴定中的应用。

在人工气候室条件下水培保鲜桑树新梢，再用桑断枝烂叶病FSX-FHC菌株的分生孢子及菌丝块接种，均可引起桑叶和桑枝产生与田间表现一致的症状。接种后2 d出现褐色病斑，此后病斑迅速扩大，接种后5 d病斑停止扩大，形成分生孢子器，病斑处变薄易破，症状表现与田间发病完全一致。该接种方法为本文首创，该方法具有操作简单、测试准确、试材易备、随时可试的特点，可在短期内快速的进行多次试验，可用于不同病害的病原鉴定、抗性评价和病原菌复壮、保存等相关试验。

3.2 断枝烂叶病病原菌侵染为害桑树的部位主要是新梢的叶片和枝茎

病原菌对半年以上成熟枝、老枝没有致病力，对顶端4节以上的嫩枝、嫩叶致病力最强。因此，在进行断枝烂叶病的病原菌致病性测试、桑品种抗病性测试等相关试验时，应选新梢相同节位的叶片或枝段接种。而在生产实际中应重点保护嫩枝嫩叶，预防断枝烂叶病的发生与为害。

3.3 病害的流行与气候条件的关系有待进一步研究

田间实地调查发现，发病的桑园多分布于岩溶峰丛洼地、盘地，四面环山，比较避风，春季长期大雾缭绕、空气湿度大等具有特定地理位置和独特气候条件。而在人工接种过程中，也发现温度20～25℃，湿度95%～100%时，病害接种成功率最高并能使病斑迅速扩展蔓延。因此，病害发生是否与特殊的气候条件有关有待进一步研究。

［1］ 朱方容.桂西蚕区发生罕见桑树病害的诊断及防控措施［EB/OL］.（2011-05-05）［2016-05-15］.http：//www.gxcy.gov.cn/tytg/ShowArticle.asp？ArticleID=45104.

［2］ 谢玲，岑贞陆，朱方容，等.桑树细菌性枯萎病病菌致病性测定的人工接种方法［J］.蚕业科学，2012，38（6）：1133-1136.

［3］ 王瑜，刘怡，周彬彬，等.苜蓿对匍柄霉叶斑病与茎点霉叶斑病的抗性评价研究［J］.草业学报，2015，24（7）：155-161.

［4］ 高苇，李宝聚，石延霞，等.茄子棒孢叶斑病病原菌鉴定及致病性研究［J］.植物病理学报，2012，42（2）：113-119.

S888.71；

A；

1006-1657（2016）02-0012-4

2016-04-25；

2016-05-20

广西“十二五”科技规划重大专项项目及课题（No.桂科重14121002，No.桂科重14121002-4-4），现代农业产业技术体系建设专项（No.CARS-22），八桂学者建设工程专项（No.2011104-16）。

信息］陈小青（1979—），女，本科，农艺师，从事桑树病虫害防治研究。E-mail：326401251@qq.com

信息］朱方容（1962—），男，本科，研究员。E-mail：gxzfr@126.com