人CARABIN蛋白过表达慢病毒载体构建及其稳定表达细胞株的筛选

刘凯玉，蒋 维，王瑞娜，吴家雪，党永军

(1. 复旦大学 生命科学学院， 上海200000; 2. 复旦大学 基础医学院， 上海 200032)

人CARABIN蛋白过表达慢病毒载体构建及其稳定表达细胞株的筛选

刘凯玉1，蒋 维2，王瑞娜2，吴家雪1，党永军2

(1. 复旦大学 生命科学学院， 上海200000; 2. 复旦大学 基础医学院， 上海 200032)

摘要构建并鉴定人CARABIN蛋白过表达慢病毒载体，筛选CARABIN过表达的弥散性大B淋巴瘤细胞SU-DHL-6的稳定细胞株。通过设计Carabin上下游引物，用同源重组的方法构建慢病毒载体pLENTI-cGFP-CARABIN，将其与psPAX2和pMD2.G包装质粒按3∶2∶1的比例用PEI Transfection Reagent 共转染HEK293T细胞制备病毒，用病毒颗粒感染SU-DHL-6细胞2周后，用流式细胞仪分选GFP表达阳性的细胞，Western Blot检测CARABIN-GFP融合蛋白表达。成功构建pLENTI-cGFP-CARABIN慢病毒过表达载体。包装病毒颗粒并感染SU-DHL-6细胞后，荧光显微镜检测和流式细胞分选鉴定表达效率为26.5%，筛选出的GFP阳性细胞用Western Blot检测到CARABIN-GFP融合蛋白表达。成功构建了Carabin过表达慢病毒载体并筛选出了CARABIN-GFP稳定表达的细胞株。

关键词CARABIN; 过表达; 稳定细胞株; 弥散性大B淋巴瘤

同源重组是指发生在姐妹染色单体间或同一染色体上含有同源序列的DNA分子间或分子内的重新组合[1,2]。我们利用Vazyme公司的同源重组试剂盒，可以高效快速地构建克隆。慢病毒(lentivirus)对非分裂期和分裂期的细胞均具有感染能力，可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，使宿主细胞持久地表达外源基因[3，4]。慢病毒能成为实现基因长期稳定高效表达的理想载体[5]。慢病毒载体来源于多种严重致病性病毒，实验操作时具有一定的危险性，需要采取一些防护措施以确保其安全性[6，7]。……