锁阳对大鼠肝纤维化干预作用的实验研究*

李荣华，林友胜，王航宇，李卉园，黄小梅，唐琳梅，邓峰美△

1.成都医学院 基础医学院(成都　610500); 2.石河子大学 药学院(石河子　832000)



锁阳对大鼠肝纤维化干预作用的实验研究*

李荣华1，林友胜1，王航宇2，李卉园1，黄小梅1，唐琳梅1，邓峰美1△

1.成都医学院 基础医学院(成都610500); 2.石河子大学 药学院(石河子832000)

【摘要】目的观察锁阳对四氯化碳(CCl4)诱导的大鼠肝纤维化模型的预防及逆转作用。方法将SD大鼠按照随机数字表法分为正常对照组、模型组、锁阳干预Ⅰ组、锁阳干预Ⅱ组和锁阳对照组5组，每组各10只。CCl4与花生油混合液造模，根据分组在不同时间给予锁阳灌胃。实验结束后,取血清和肝组织，检测血清肝功能，HE染色和Masson染色，观察肝组织病理改变，流式细胞仪测大鼠血浆 CD3+、CD4+和CD8+水平。结果模型组大鼠肝组织纤维化分级主要以++++级为主，锁阳干预Ⅰ组分级主要以++、+++级为主，锁阳干预Ⅱ组分级主要以+、++为主。与正常对照组比较，模型组大鼠血清AST、ALT活性明显升高，CD3+、CD4+水平降低，CD8+水平升高，肝脏指数升高。与模型组相比，锁阳干预Ⅰ组大鼠血清中ALT活性降低，CD3+、CD4+水平升高，CD8+水平降低；锁阳干预Ⅱ组中大鼠血清中AST、ALT活性明显降低，CD3+水平升高，CD8+水平降低；两组大鼠肝脏指数均降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。结论锁阳对肝纤维化有一定的预防和逆转作用，同时能影响肝纤维化大鼠外周血T淋巴细胞亚群，在一定程度上拮抗免疫功能低下。

【关键词】锁阳；肝纤维化；四氯化碳

肝纤维化(liver fibrosis,LF)是一种可逆的损伤-修复反应，其特征是肝损伤后的细胞外基质(extracellular matrixc,ECM)异常增生[1]。如果肝损伤是急性或者自限性的，ECM的增生就是暂时的，肝脏的组织成分、细胞类型可恢复至正常状态。如果损伤持续会造成慢性炎症，进而ECM增生，导致肝实质细胞被瘢痕组织取代[2]，最终导致肝硬化，死亡率较高[3]。研究[4]表明，阻止或减慢肝纤维化的发生发展，是治愈大多数慢性肝病患者的关键。因此，阻止肝纤维化的恶变，预防和逆转尤为重要。中药在改善症状和减轻肝脏病理改变方面优于西药。锁阳作为传统的中药，对很多疾病有治疗效果，被称为“药中之宝”[5]。本课题组在对锁阳的研究基础[6-7]上，分离出15种单体，发现单体Songarin A对肝损伤细胞模型有保护作用[8]。因此，本实验采用锁阳对肝纤维化大鼠进行干预，探讨锁阳对大鼠肝纤维化的作用，为今后锁阳用于临床治疗肝纤维化提供理论依据。

1材料与方法

1.1材料

秋水仙碱(每1 mL蒸馏水中加入0.1 mg秋水仙碱粉末，制成水溶液)(云南玉药生物制药有限公司)；四氯化碳(CCl4)分析纯AR(成都科龙化工试剂厂)；锁阳(新疆石河子大学药学院提取配制，浓度为30 mg/mL)；谷丙转氨酶与谷草转氨酶测定试剂盒(南京建成生物公司)；CD4+/CD8+/CD3+抗体(美国BD公司)；苏木精与伊红(武汉博士德公司)；二甲苯与酒精(成都迎辉化工有限公司)。Roche Modular D2400 生化分析仪(瑞士Roche公司)；离心机HC-2518(安徽中科中佳科学仪器有限公司)；FACSCalibur流式细胞仪(美国BD公司)；BH-2型光学显微镜(日本Olympus公司)。雄性SD大鼠50只，SPF级别，体质量160～180 g，购自成都达硕公司，实验动物生产许可证：SCXK(川)2013-024。控制室内温度为(20±2) ℃，相对湿度35%～40%，明暗各12 h(明7:00～19:00，暗19:00～7:00)，自来水自由饮用，常规饲料。大鼠适应喂养1周，称重。

1.2造模与给药

大鼠按照随机数字表法分为正常对照组、模型组、锁阳干预Ⅰ(提前给药)组、锁阳干预Ⅱ(边造模边给药)组和锁阳对照组5组，每组10只。正常对照组与锁阳对照组大鼠前6周3 mL/kg，2次/周，皮下注射花生油；后6周，正常对照组大鼠给予生理盐水，锁阳对照组大鼠给予锁阳(200 mg/kg)灌胃，1次/d，持续6周；模型组大鼠以3 mL/kg(实验首次5 mL/kg)，2次/周，皮下注射由CCl4和花生油按照4∶6配成的混合液，复制肝纤维化模型，后6周等容生理盐水灌胃，1次/d；锁阳干预Ⅰ组大鼠前6周以200 mg/kg，1次/d，灌胃锁阳；后6周复制模型；锁阳干预Ⅱ组大鼠边造模边以200 mg/kg，1次/d， 灌胃锁阳。

在喂食大鼠饲料、造模操作和给药操作的时候称重，并对大鼠的毛色、精神、行为、饮食量和摄水量等一般情况进行观察记录。

1.3取材

取材前24 h禁食不禁水，所有动物称重。取大鼠静脉血3 mL放置于1 mL静脉血加20 μL 7.5%EDTA混合的抗凝管中，混匀，用于流式细胞术检测；将大鼠固定，腹腔注射水合氯醛麻醉，开腹后用5 mL注射器腹主动脉取血，2 mL注入血常规无菌真空采血管；剩余血液分装到1.5 mL EP管中，静置至血液凝固后离心分装放置于-20 ℃冰箱。采血时避免血液滴到EP管壁，发生溶血。转移血液时，尽量减少震荡，以免溶血。离心机提前15 min预热；将肝脏取出后，去除系膜，用冷生理盐水冲尽残血，滤纸吸干。

观察大鼠肝脏光滑度、颜色和硬度等。称重，并按照下述公式计算肝脏指数。

1.4肝功能检测

按照试剂盒说明，测AST和ALT的活性。

1.5流式细胞术

取抗凝静脉全血3 mL，加于等量淋巴细胞分层液上层(注意不要破坏液体的交界面)。2 500 r/min离心10 min后，液体分为4层，用吸管小心吸取中间白色细胞层于新的离心管中。加入pH 7.2～7.4的PBS 3 mL混匀后1 000 r/min离心5 min，弃上清，加入200 μLPBS混匀，用血球计数板计数细胞，调整各待测管细胞浓度。取100 μL上述抗凝血加入流式管中，加入5 μL CD4+/CD8+/CD3+抗体。加入2 mL的1×溶血素后轻轻摇动，并在室温下避光孵育15 min。离心15 min，力度200 g，取上清(注意不要触动下面的沉淀)。加入2 mL的1×PBS，洗涤淋巴细胞。离心5 min，力度200 g。轻轻吸出上清液，加入0.5 mL的1×PBS，重新悬浮细胞。用流式细胞仪上机检测。

1.6HE染色与Masson染色

取肝组织，进行常规脱水，包埋。连续冠状位切片，切片厚度4 μm，进行HE和Masson染色。HE染色后，肝组织中细胞核呈现出蓝紫色，细胞浆呈红色。Masson染色后，肝组织中胶原纤维呈蓝色。用显微镜观察拍照，观察肝脏组织学变化并对大鼠肝组织进行评分。

《肝纤维化分期半定量评估系统，Ishak》方法：-：无纤维化；+：有些汇管区纤维化，纤维隔短；++： 汇管区纤维化，纤维隔形成；+++：多数汇管区纤维化，偶有汇管区桥接纤维化；++++：汇管区纤维化，伴有明显的汇管-汇管桥接纤维化和汇管-中央桥接纤维化。评估大鼠纤维化情况。按-为0分， +为1分，++为2分， +++为3分，++++为4分计，按积分制标准，进行比较。

1.7统计学方法

2结果

2.1一般情况比较

正常对照组大鼠皮毛保持光滑有亮泽，喜欢活动，经常打斗，饮食正常，无死亡，10只；锁阳对照组较正常对照组大鼠体格更健壮，反应更灵敏，活动度更高，无死亡，10只；模型组大鼠则出现不同程度的精神不振，反应迟钝，进食饮水逐渐减少，毛色晦暗，毛发略显紊乱，尿黄臭，粪便稀薄，缺乏光泽，死亡2只，余8只；锁阳干预Ⅰ组与模型组大鼠相比，饮食、毛色等状态好，皮肤溃烂后愈合较快，死亡1只，余9只；锁阳干预Ⅱ组大鼠给药后食欲、精神状态亦随之好转，余9只。各组大鼠在实验过程中的体质量变化情况：正常对照组大鼠体质量基本属于稳定增长；模型组大鼠体质量持续下降；锁阳干预Ⅰ组大鼠在进食锁阳后体质量上升，在随后的造模期间，体质量下降；锁阳干预Ⅱ组大鼠在造模期间体质量下降，给药和造模结束后，体质量平稳，变化不大；锁阳对照组大鼠在进食锁阳后，体质量上升(图1)。

图15组大鼠的体质量变化比较

2.2大鼠血清肝功能指标的变化

与正常对照组相比，模型组大鼠血清中AST、ALT活性升高，差异具有统计学意义(P<0.05)；与模型组相比，锁阳干预Ⅰ、Ⅱ组大鼠血清中ALT活性降低，锁阳干预Ⅱ组大鼠血清中AST活性降低，差异具有统计学意义(P<0.05)(表1)。

注：与正常对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05

2.3大鼠血清中CD3+、CD4+、CD8+水平的变化

与正常对照组比较，模型组大鼠的血清中T淋巴亚群CD3+、CD4+比例降低，CD8+比例提高，存在明显的免疫功能低下，差异有统计学意义(P<0.05)；锁阳对照组大鼠血清中的CD3+、CD4+比例与正常对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，锁阳各组大鼠血清中的CD3+、CD4+水平提高，CD8+水平下降，差异有统计学意义(P<0.05)(表2)。

2.4大鼠肝脏大体观察

正常对照组大鼠肝脏颜色鲜艳，表面光滑，质地柔软；锁阳对照组大鼠肝脏表面更加鲜亮，质地更加松软；模型组大鼠肝脏颜色明显发白，边缘钝，表面粗糙，呈结节状，质地僵硬；锁阳干预Ⅰ组大鼠肝脏比模型组稍好，但有很多结节，光滑度弱；锁阳干预Ⅱ组大鼠肝脏光泽恢复，边缘锐圆(图2)。

注：与正常对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05

图25组大鼠肝脏大体标本比较

注：A：正常对照组；B：模型组；C：锁阳干预Ⅰ组；D：锁阳干预Ⅱ组；E：锁阳对照组

2.5大鼠肝脏指数的变化

与正常对照组相比，模型组大鼠肝脏指数升高，差异有统计学意义(P<0.05)；锁阳各组肝脏指数明显降低，差异具有统计学意义(P<0.05)(表3)。

注：与正常对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05

2.6大鼠肝脏病理组织学的变化

HE染色可以观察到正常对照组大鼠肝小叶结构清晰，肝细胞正常，汇管区及汇管区周围未见小胆管及纤维组织增生；模型组大鼠正常肝小叶结构有破坏，肝细胞脂肪沉积，胞质内呈现空泡状，肝小叶结构模糊，肝纤维化明显；锁阳给药组大鼠肝组织病理情况好转，仅有部分细胞脂肪空泡；锁阳对照组大鼠肝小叶结构清晰，小叶内肝细胞基本正常，汇管区结构清晰(图3)。Masson染色可以看到正常对照组大鼠肝组织在汇管区有极少胶原纤维的表达，细胞索排列非常整齐；模型组大鼠肝组织有假小叶生成，纤维间隔着色明显，胶原沉积，肝纤维化明显；锁阳给药干预后，变性细胞和胶原沉积减少，肝纤维化程度减轻；锁阳对照组大鼠肝组织基本上没有胶原的表达，细胞排列整齐(图4)。

2.7大鼠肝纤维化程度分级

与正常对照组比较，模型组大鼠肝组织纤维化评分比较，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，锁阳干预Ⅰ组和干预Ⅱ组大鼠肝组织纤维化评分明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)(表4)。

注：与正常对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05

图35组大鼠肝组织 HE 染色结果比较(×10)

注：A:正常对照组；B:模型组；C:锁阳干预Ⅰ组；D:锁阳干预Ⅱ组；E:锁阳对照组

图45组大鼠肝组织 Masson染色结果比较(×10)

注：A：正常对照组；B：模型组；C：锁阳干预Ⅰ组；D：锁阳干预Ⅱ组；E：锁阳对照组

3讨论

肝纤维化的发生是由多种致病因子共同介导的病理过程。本实验研究锁阳对CCl4诱导大鼠肝纤维化的保护作用。CCl4在肝脏中产生脂质过氧化反应，对大鼠肝脏造成损伤。取材后，计算肝脏指数，它是动物功能状态的重要指标，且根据肝脏质量、肝脏指数可以判断肝脏病变的性质和程度。选取可准确反映肝细胞炎症活动和坏死的AST、ALT肝功能指标进行检测。HE染色技术染色稳定，是最常用且可靠的诊断方法。Masson染色常用于胶原纤维和肌纤维的鉴别，对肝纤维化程度的判断具有直观性，因此本研究对各组大鼠肝组织进行了这两种方法的染色。其结果显示：模型组大鼠肝脏指数增大，大鼠肝脏颜色发黄，表面粗糙，呈颗粒状，极其僵硬；AST、ALT的活性高于正常组；病理切片显示其组织发生细胞变性、纤维组织生成等改变，造模成功。

淋巴细胞中的T细胞在人体免疫系统中发挥重要作用。成熟的T细胞分布于外周免疫器官的胸腺依赖区，并可经淋巴管、外周血和组织液等进行再循环，发挥细胞免疫及免疫调节的功能。T细胞的再循环有利于广泛接触进入体内的抗原物质，加强免疫应答，较长期保持免疫记忆。T细胞的细胞膜上有许多不同的标志，主要是表面抗原和表面受体。这些表面标志都是结合在细胞膜上的巨蛋白分子[9]。CD3+、CD4+和CD8+是T淋巴细胞的3个主要亚群。CD3+分子表达在T细胞上，是T细胞的重要标记物；辅助T细胞的主要表面标志是CD4+，CD4+细胞可协助B细胞分泌抗体和调节其他T细胞的免疫应答；细胞毒T细胞的主要表面标志是CD8+，也被称为杀手T细胞，它常表现为细胞毒活性，是主要的细胞毒效应细胞[10]。研究发现，慢性病毒性肝炎患者多出现机体免疫功能失调，表现为CD4+T细胞减少，CD8+T细胞增多。CD8+T细胞在攻击病原体感染肝细胞同时加重肝组织损伤[11]。本研究部分实验表明，与模型组比较，锁阳各组大鼠CD3+、CD4+水平提高，CD8+水平下降，差异有统计学意义，锁阳干预Ⅰ组的CD4+水平高于干预Ⅱ组，锁阳对照组的结果优于正常对照组，提示在一定程度上，锁阳能影响大鼠外周血T淋巴细胞亚群比例。

本研究观察到提前给药组比模型组的大鼠肝脏外观光滑，边造模边给药组大鼠肝脏更优；在提前给药组和边造模边给药组，其大鼠血清中AST和ALT的活性均有减弱；HE和Masson染色结果显示，相比模型组，提前给药组和边造模边给药组大鼠肝细胞变性与大鼠肝纤维增生情况明显改善，说明锁阳对肝纤维化存在一定的预防和逆转作用。2009年有研究[12]发现锁阳可以通过增加血液端粒长度使小鼠长寿；3年后，有一项在果蝇上进行实验的研究[13]称，锁阳能延缓衰老，延长寿命。

综上所述，提前给大鼠灌胃锁阳能保护肝脏；在造模过程中用锁阳干预能逆转肝纤维化，减弱肝纤维化的进程；锁阳对照组结果说明：正常大鼠对锁阳不会出现异常反应，甚至能提高免疫细胞的比例。

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Experimental Study of Intervention Effects of Cynomorium Songaricum on Liver Fibrosis of Rats

LiRonghua1,LinYousheng1,WangHangyu2,LiHuiyuan1,HuangXiaomei1,TangLinmei1,DengFengmei1△.

1.SchoolofBasicMedicalSciences,ChengduMedicalCollege,Chengdu610500,China; 2.SchoolofPharmacy,ShiheziUniversity,Shihezi832000,China

【Key words】Cynomorium songaricum; Liver fibrosis; Carbon tetrachloride

【Abstract】ObjectiveTo observe the preventive and reversal effects of Cynomorium songaricum on liver fibrosis of rats induced by carbon tetrachloride (CCl4). MethodsSD rats were randomly divided into the normal control group, the model group, the Cynomorium songaricum intervention Ⅰ group, the Cynomorium songaricum intervention Ⅱ group and the Cynomorium songaricum control group. Each group consisted of 10 rats, which were injected subcutaneously with the mixture of carbon tetrachloride and peanut oil to make the models of liver fibrosis. Then the rats were given Cynomorium songaricum via intragastric administration at different time in the different groups respectively. Serum and livers were collected after all the rats were sacrificed at the end of the experiment. Hematoxylin and eosin red (HE) staining and Masson staining were used to observe the pathological changes of liver tissue, and flow cytometry was used to measure the levels of CD3+, CD4+and CD8+in the plasma. Results According to the grading of liver fibrosis, liver tissue of the rats in the model group mainly belong to grade ++++, the liver tissue of the rats in the Cynomorium songaricum intervention Ⅰ group were mainly in grade ++ and grade +++ and the liver tissue of the rats in the Cynomorium songaricum intervention Ⅱ group were mainly in grade + and grade ++. Compared with the normal control group, the activities of AST and ALT in the serum of the rats in the model group were significantly increased, the levels of CD3+and CD4+were reduced, the level of CD8+was increased, and the liver index was elevated. Compared with the model group, the activities of ALT in the serum of rats in the Cynomorium songaricum intervention Ⅰ group was lower, the levels of CD3+and CD4+were higher,and the level of CD8+was lower; The activities of AST and ALT in the serum of rats in Cynomorium songaricum intervention Ⅱ group was lower, the levels of CD3+and CD4+were higher, and the level of CD8+was lower; The liver index of rats in both intervention groups were decreased. All the differences mentioned above were statistically significant (P<0.05). ConclusionCynomorium songaricum has good preventive and reversal effects on liver fibrosis. Meanwhile, it has certain effects on T lymphocyte subgroups in peripheral blood of rats with liver fibrosis and it can improve their immune hypofunction to a certain degree.

doi:10.3969/j.issn.1674-2257.2016.03.002

*基金项目：国家自然科学基金资助项目(No：81560566)

通信作者：△邓峰美，E-mail: dengfm2004@163.com

【中图分类号】R285.5

【文献标志码】A

网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1705.R.20160613.1645.038.html

·论著·