布洛芬混悬滴剂抑菌剂剂量筛选与抑菌效力研究

夏哲林，周彬

(1.浙江省台州市中心医院 药剂科，浙江 台州 318000；2.温州医科大学附属第一医院 药学部，浙江 温州 325000)

布洛芬混悬滴剂抑菌剂剂量筛选与抑菌效力研究

夏哲林1Δ，周彬2

(1.浙江省台州市中心医院 药剂科，浙江 台州 318000；2.温州医科大学附属第一医院 药学部，浙江 温州 325000)

目的 筛选适用于布洛芬混悬滴剂的抑菌剂剂量。方法 用不同配比浓度的抑菌剂对布洛芬混悬滴剂的抑菌效果考察，筛选出适宜的抑菌剂加入量，根据抑菌效力评价标准评价不同浓度抑菌剂的抑菌效力。结果 0.4%的苯甲酸钠对微生物生长繁殖有良好的抑制作用，且为最低有效剂量。结论 0.4%的苯甲酸钠可以作为布洛芬混悬滴剂的抑菌剂。

布洛芬混悬滴剂；剂量筛选；抑菌效力；苯甲酸钠

1 材料与方法

1.1 仪器与试药

1.1.1 仪器：UV2550紫外分光光度计(日本岛津仪器(苏州)有限公司)；SPX-150C型恒温培养箱(上海博迅实业有限公司医疗设备厂)；BI01200-Ⅱ-A2生物洁净安全柜(上海振梓创空气净化设备有限公司)；LMQ.6立式压力蒸气灭菌器(山东新华医疗器械股份有限公司)；BS210S电子天平[梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司]。

1.1.2 试药：菌种：铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa) [CMCC(B)10104]、大肠埃希菌(Escherichiacoli)[CMCC(B) 44102]、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)[CMCC( B) 26003]、白色念珠菌(Candidaalbicans)[CMCC(F)98001]、黑曲霉(Aspergillusniger)[CMCC(F)98003]均购自中国食品药品检定研究院医学菌种保藏中心，工作中均使用第3代传代菌种。

培养基：胰酪大豆胨液体培养基(批号:151013)、胰酪大豆胨琼脂培养基(批号:151025)、沙氏葡萄糖液体培养基(批号:150922)、沙氏葡萄糖琼脂培养基(批号:151018)均购自北京三药科技开发公司。各培养基均经适用性试验，结果符合现行药典要求。

1.1.3 样品：根据布洛芬混悬滴剂的处方制成含不同浓度抑菌剂的样品。a组(含0.1%苯甲酸钠的供试品)；b组(含0.2%苯甲酸钠的供试品)；c组(含0.3%苯甲酸钠的供试品)；d组(含0.4%苯甲酸钠的供试品)；e组(含0.5%苯甲酸钠的供试品)。

1.2 方法

1.2.1 菌液的制备：

① 细菌培养物的制备：在TSA培养基斜面上接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌，将培养基置于35 ℃的培养箱中培养24 h,用适量无菌生理盐水洗脱上述琼脂培养基表面，将培养物洗脱，采用比浊法制成每1 mL含菌数约为108cfu的菌悬液。

当苗有3对叶以后，每周对池水消毒1次，每2个月更换1次池水。施肥用复合肥(氮∶磷∶钾=15∶15∶15)加水配成800倍液均匀注入水池中；同时用磷酸二氢钾1 000倍液在早上或傍晚进行叶面追肥。复合肥每月追施1次，叶面肥每月追施2次。经炼苗后，幼苗长至高10～15厘米、茎粗2～5毫米时即可移栽。

② 真菌培养物的制备：白色念珠菌接种到SDA培养基斜面上，将培养基置于25 ℃的培养箱中培养48 h。用适量无菌0.9%NaCl溶液洗脱上述琼脂培养基表面，将培养物洗脱，采用比浊法制成每1 mL含菌数约为108cfu的菌悬液。黑曲霉采用SDA培养基，同样置培养箱中于培养7 d，温度设为25 ℃。要求制取每1 mL含孢子数108cfu的孢子悬液，方法如下：取新鲜培养物，用5 mL含0.05%(mL/mL) 聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液洗脱孢子，并用无菌试管收集孢子悬液，用适量溶剂稀释制得。

1.2.2 抑菌剂浓度筛选：

① 第一次筛选实验：考察含不同浓度苯甲酸钠的供试品，对5种试验菌的抑制作用。观察试验菌生长与否，分别用“+”和“-”表示，然后根据试验结果寻找适当的浓度区间进行正式试验。文中实验对照苯甲酸钠的常用量，分别选取0.02%、0.05%、0.1%、0.2%、0.5%、1.0%浓度的抑菌剂进行试验。

② 第二次筛选实验：根据第一次筛选实验结果中对所选抑菌剂抗性作用最强的微生物为试验菌进行第二次筛选。供试品试验组分配如下：a组(含0.1%苯甲酸钠的供试品)；b组(含0.2%苯甲酸钠的供试品)；c组(含0.3%苯甲酸钠的供试品)；d组(含0.4%苯甲酸钠的供试品)；e组(含0.5%苯甲酸钠的供试品)。每组取供试品1瓶(装量10 mL)，接种铜绿假单孢菌，使接种后供试品中接菌量最终浓度约为105～106 cfu/mL，充分混合，于25 ℃避光条件培养。

1.2.3 微生物计数方法适用性试验[2]：根据第2次筛选实验结果选择最佳供试品中抑菌剂的添加量，进行抑菌效力测定。供试品的微生物计数方法应进行方法适用性试验，以确认所采用的方法适合于该产品的微生物计数。取含有最佳抑菌剂添加量的供试品，用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液稀释制成1:10的供试液。加入5种试验菌液，混匀，使每mL供试液中含菌量不大于100 cfu，采用平皿法进行菌落计数。

1.2.4 抑菌效力试验：

① 供试品制备：取含有最佳抑菌剂添加量的供试品5瓶(装量10 mL)，分别转移至5支具塞无菌玻璃试管中，备用。

② 供试品接种：取上述5批供试液，每批5份，置于无菌试管中，接种“1.2.1”项下的制备好的菌悬液，接种量为100 μL，使每ml供试品中接菌量为105～106 cfu，振荡摇匀，然后将接种后的供试品置温度设为25 ℃的培养箱中，避光培养。

③ 存活菌数测定：根据口服制剂抑菌效力判断标准规定的间隔时间，于供试品刚接种的0、14、28 d，精密量取上述加菌供试液1 mL，稀释成适当的稀释级。菌数测定方法按“1.2.3”项下适用性试验后的方法进行菌落计数。全部采用直接接种法，细菌和真菌不同之处在于培养基的选择，分别是TSA培养基和SDA培养基，观察计数，最终以对数值表示即lg值。

2 结果

2.1 筛选实验

2.1.1 第一次筛选实验：结果见表1。浓度高于0.5%的抑菌剂表现出对全部5种试验菌较强的抑制作用，而低于0.1%浓度的抑菌剂则表现出对部分菌或全部试验菌无抑制作用。故笔者对此区间的抑菌剂浓度进行进一步的细分，计划浓度如下：0.1%、0.2%、0.3%、0.4%和0.5%。

表1 第一次筛选实验结果

2.1.2 第二次筛选实验：首次筛选实验中铜绿假单胞菌对所选择的抑菌剂抗性作用最强，故选择0.1%～0.5%浓度的抑菌剂以铜绿假单胞菌为试验菌进行第二次筛选。结果见表2。5个试验组中，d组和e组供试品的细菌计数14 d菌数下降值大于3.0 lg，且28 d菌数未有增加，表现出有效的抑制作用。即抑菌剂含量在0.4%以上可有效抑制铜绿假单胞菌的生长繁殖。而a组供试品则表现出在此剂量下无抑菌作用。b组和c组虽然有抑菌作用，但是抑菌效果可能未达到标准要求。综合考虑上述因素，最低有效抑菌浓度应在0.3%～0.4%之间。由于需要考虑到在药物的生产过程中，抑菌剂添加量的允许偏差是±20%。因此，在药物的处方设计阶段应对抑菌剂处方浓度可能产生的偏差即最低至80%处方浓度进行有效性确认，保证抑菌作用的有效性不受投料偏差的影响。故选择d组(含0.4%苯甲酸钠)作为供试品中抑菌剂的添加量，进行了抑菌效力的测定。

表2 第二次筛选实验结果

2.2 微生物计数方法适用性试验 结果见表3。

表3 1:10供试液平皿法验证结果

2.3 抑菌效力试验 结果表明，14 d细菌数下降不少于3.0对数值，14 d到28 d细菌数未见增加；真菌计数结果同样令人满意，14 d菌数下降不少于3.0对数值，14 d到28 d细菌数未见增加，故抑菌剂含量为0.40%的供试品抑菌效力试验结果符合判定标准。见表4～表7。

表4 5种试验菌初始菌量计数结果(cfu/mL)

表5 供试品14、28 d菌量计数结果(cfu/mL)

表6 抑菌效力结果判定表

表7 抑菌效力试验结果判定标准

3 讨论

《中华人民共和国药典》2015年版将原2010年版中的抑菌效力检查法指导原则升级为抑菌效力检查法。其中口服制剂、口腔黏膜制剂、直肠给药制剂中抑菌剂的抑菌效力判断标准较《中华人民共和国药典》2010年版中原2类供试品和3类供试品更加严苛[4]，由原标准的细菌数14 d下降1.0 lg或2.0 lg提高到3.0 lg，真菌数14 d不再增加改为下降1.0 lg。已上市品种的抑菌剂效力极可能达不到中国药典2015年版抑菌效力的要求[5-7]，药品生产厂家或研发机构需对原处方重新进行试验设计以满足新版药典的相关要求，同时监管部门应增加抑菌效力项目的监督抽查力度以加强对抑菌剂的监管。

“抑菌效力检查法(通则1121)”规定存活菌数测定方法适用性试验试验菌的回收率不得低于70%，其计算方法参照“非无菌产品微生物限度检査：微生物计数法(通则1105)”，即试验组菌落数减去供试品对照组菌落数的值与菌液对照组菌落数的比值大于0.7[8]。与上版药典相比，未明确规定需做3次独立的平行试验，为了保证实验的准确性，本文仍然采用上版要求，进行了3次平行实验。

文中布洛芬混悬滴剂为多剂量包装的儿童用药，在使用过程中需多次开启，存在微生物污染的潜在风险，稍有不慎，即有可能对患儿造成伤害。笔者通过对不同浓度的抑菌剂苯甲酸钠试验，力求在更低的浓度范围，在保证药品安全稳定有效的同时，尽量接近最低有效浓度。为了提高工作效率，参考相关文献，选择对苯甲酸钠抗性相对较大的铜绿假单胞菌进行了两步筛选。试验结果表明，0.4%的苯甲酸钠加入量可以满足工业生产中可能的±20%偏差下的抑菌效力。

综上所述，参照现行《中国药典》关于抑菌剂和抑菌效力检查法的相关规定，本处方对方法中的各试验菌有较强的抑制能力，0.4%的苯甲酸钠可用作布洛芬混悬滴剂的抑菌剂。

[1] 胡皓夫.现代儿科治疗学[M].北京：人民军医出版社，1999：216-219.

[2]国家药典委员会.中华人民共和国药典[S].四部，2015：23-24.

[3]上海医药工业研究院药物制剂部.药用辅料应用技术[M].北京：中国医药科技出版社，2001：344-362.

[4]国家药典委员会.中华人民共和国药典[S].二部,2010：215-216.

[5]刘艳，王志宏，曲金瑶,等.乙酰半胱氨酸口服溶液抑菌剂抑菌效力研究[J].中国药事，2015，34(3)：152-155.

[6]江志杰，李玉立，刘文杰,等.吡诺克辛滴眼液的抑菌效力评价[J].中国现代应用药学，2015，32(6):704-708.

[7]李珏，王知坚，相露婷.苄达赖氨酸滴眼液中抑菌剂的检测与评价[J].药物分析杂志，2015，35(5):884-888.

[8]肖璜，林吉恒，陈万胜,等.四国药典中抑菌效力检查法的比较[J].中国药品标准，2014，15(1):10-12.

(编校：王俨俨)

Screening concentration of antimicrobial preservative for ibuprofen suspension and its antimicrobial effectiveness

XIA Zhe-lin1Δ, ZHOU Bin2

(1.Department of Pharmacy, Taizhou Central Hospital, Taizhou 318000, China; 2.Department of Pharmacy, The Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou 325000, China)

ObjectiveTo investigate the optimal concentration of antimicrobial preservative that was added to ibuprofen suspension.MethodsThe antimicrobial effectiveness of antimicrobial preservatives at different ratio were evaluated and the optimal concentration was screened.The antimicrobial effectiveness of antimicrobial preservatives was evaluated by criterion of inhibitory effectiveness.ResultsThe growth of test microorganisms were inhibited effectively by 0.4% sodium benzoate added to ibuprofen suspension which was also the minimum effective dosage.Conclusion0.4% sodium benzoate could be used as antimicrobial preservative for ibuprofen suspension.

ibuprofen suspension; inhibition dose; antimicrobial effectiveness; sodium benzoate

夏哲林，通信作者，男，本科，主管药师，研究方向：药事管理及药物临床试验，E-mail：2858141295@qq.com。

R284.1

A

10.3969/j.issn.1005-1678.2016.03.51