番鸭三种细小病毒多联PCR检测方法的建立与初步应用

季艳菊，王林川

（1. 惠州工程技术学校，广东惠州 516000；2. 华南农业大学兽医学院，广东广州 510642）



番鸭三种细小病毒多联PCR检测方法的建立与初步应用

季艳菊1，王林川2

（1. 惠州工程技术学校，广东惠州 516000；2. 华南农业大学兽医学院，广东广州 510642）

摘 要：根据GenBank中番鸭“三周病”病毒（MDPV）、小鹅瘟病毒（GPV）的NS基因和VP基因，以及华南农业大学禽病组分离到的细小病毒型“白点病”病毒（MDWNV）的NS和VP基因序列，设计3对特异性引物，并在建立单项PCR技术的基础上，优化多联PCR反应条件（EX-Taq DNA聚合酶浓度、引物浓度、dNTPs浓度以及退火温度等），建立了MDPV、MDWNV和GPV三种病毒的多联PCR检测方法。本研究结果表明，该番鸭三种细小病毒多联PCR检测方法具有特异、快速、准确、敏感的特点，能同时鉴别诊断这三种番鸭细小病毒，并可直接应用于临床典型病变组织的检测。

关键词：番鸭细小病毒；多联PCR；建立；初步应用

近十年来，番鸭“三周病”（MDPV）、细小病毒型“白点病”（MDWNV）和小鹅瘟（GPV）是严重危害番鸭饲养业的传染病。这三种疾病引起番鸭临床发病的日龄相差不大，发病率及死亡率均较高，常在同一地区流行[1]，并会发生混合感染。同时该三种病毒的DNA序列相似性达到80%以上，因而临床鉴别诊断难度较大，常规诊断方法很难确诊，误诊现象严重，影响了对这三种疫病防治的有效实施。基于此，本研究在建立单项PCR技术的基础上，优化多联PCR反应条件，建立了三种病毒的多联PCR检测方法[2]，以便特异、快速、准确、敏感地鉴别诊断这三种番鸭细小病毒病毒。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1病原。MDPV、GPV、MDWNV：由华南农业大学禽病教研室分离保存；呼肠孤病毒、鸭瘟病毒、鸭病毒性肝炎病毒：由华南农业大学禽病教研室保存。

1.1.2实验器材。生化培养箱、超净工作台、离心机、PCR仪、核酸蛋白测定仪、高压锅等，由惠州工程技术学校畜牧兽医教研室提供。

1.1.3试 剂。0.5 ×TBE ：Tris碱 27 g、 硼 酸13.75 g、EDTA 1.861 g，溶于双蒸水10 L；电泳上样缓冲液（6×）：0.2%溴酚蓝、50%蔗糖；dNTP Mixture、DNA Marker DL2000：购自广州瑞真生物技术有限公司；RNA抽提试剂盒：购自宝生物（大连）有限公司。EX Taq酶：购自广州瑞真生物技术有限公司。

1.1.4实验动物。健康无母源抗体雏番鸭：购自博罗番鸭孵化场，未免疫相应疫苗。

1.1.5病料。人工发病后的病死番鸭组织（肝脏、脾脏、胰腺等）病料，以及从广东、福建等地区送检的临床病料。

1.2方法

参照GenBank中细小病毒NS基因和VP基因序列，应用软件DNASTAR 5.07筛选出细小病毒科编码基因的保守序列，先后用Primer 5.0，在保守区NS片段上设计1对通用引物：上游P1和下游P2，预扩增片断约430 bp；在非保守区VP片段设计1对GPV特异性引物：上游P3和下游P4，预扩增片断约290 bp；在非保守区VP片段设计1对MDPV特异性引物：上游P5和下游P6，预扩增片断为约590 bp左右。在建立单项PCR基础上，优化EX-Taq DNA聚合酶浓度、引物浓度、dNTPs浓度以及退火温度，建立细小病毒多联PCR检测方法。

1.2.1引物之间相互影响实验。在优化MDWNV、GPV和MDPV通用引物P1、P2，GPV特异性引物P3、P4及MDPV特异性引物P5、P6单项PCR条件的基础上，为研究三对引物同时扩增其目的基因是否会因引物间相互影响而发生改变，预先加入三对引物的体积均定为1.0 μL，按如下体系（表1）进行同时扩增。反应程序为：94 ℃预变性3 min，94 ℃变性50 s，54 ℃退火50 s，72 ℃延伸为1.0 min，30个循环后，72 ℃延伸10 min进行扩增。

表1　多联PCR反应体系

1.2.2不同引物浓度变化时相互间的影响分析。据上一步实验结果发现，三对引物在同一体系进行同时扩增，引物间相互抑制现象不明显。为进一步研究引物间相互影响，在多联PCR反应中保持其中两对引物浓度不变，改变第三对引物的浓度，其引物加入量分别为1.1 μL、1.2 μL、1.3 μL、1.4 μL、1.5 μL、1.6 μL，然后进行多联PCR扩增。

1.2.3退火温度的优化。据上一步实验结果，在最优引物比例下，利用温度梯度PCR仪进行PCR扩增，选择温度分别为50.3 ℃、51.9 ℃、54 ℃、56.3 ℃、58.3 ℃、59.9 ℃，作为退火温度进行多联PCR扩增。

1.2.4诊断液的配制及其反应程序的确定。根据混合液成分及反应条件的优化结果，配制多联PCR反应混合液，后将其保存于-20 ℃冰箱，用时直接溶解，然后加入模板，用ddH2O调好体积，按优化的多联PCR反应程序直接进行扩增。

1.2.5特异性实验。按上述优化后的多联PCR反应体系及其反应程序，对MDWNV、MDPV、GPV、鸭瘟病毒DNA及呼肠孤病毒和鸭病毒性肝炎病毒的cDNA进行PCR扩增，电泳检测多联PCR反应中的引物特异性。

1.2.6敏感性实验。分别抽提MDWNV、MDPV、GPV的DNA，用核酸蛋白测定仪测定浓度后，按10倍、100倍、1 000倍梯度依次递减稀释，然后进行多联PCR敏感性实验。

1.2.7重复性实验。运用建立的多联PCR方法，分别对MDWNV、MDPV、GPV的阳性模板和阴性模板进行3～4次重复性实验，来检测多联PCR检测方法的重复性。

1.2.8病料组织检测

1.2.8.1人工发病的病死番鸭病料检测。对1日龄的非免疫番鸭人工攻毒，每株病毒攻毒5只，0.5 mL/只，连续观察2周，将病死的番鸭组织（肝脏、脾脏、胰腺等）剪碎[3]，按1:5～1:10的量加入无菌生理盐水后研磨，5 000 rpm离心10 min，取上清提取DNA，进行多联PCR检测。

1.2.8.2临床病料组织检测。用建立的多联PCR检测方法，对临床病料组织中抽提的病毒DNA直接进行检测。

2　实验结果

2.1引物之间相互影响的实验结果

引物之间相互影响的实验结果见图1A、图1B。由图1A、图1B可知，当三对引物同时扩增时，引物间的相互影响不明显，各自的扩增效率差别不大，均能扩增出明显的目的条带P3、P4扩增效率稍微降低但不明显。

2.2不同引物浓度变化的影响结果

据上一步实验结果发现，三对引物在同一体系发生扩增反应时，相互间抑制现象不明显。为进一步研究引物间随浓度变化的相互影响情况，采用固定其中两对引物浓度，改变第三对引物浓度，将第三对浓度逐渐调高进行多联PCR扩增，观察其变化。结果如图2。

由图2可知，当固定引物P1、P2和P5、P6，而增大P3、P4时，引物间的影响无明显变化；当固定引物P1、P2和P3、P4，而增大P5、P6时，1～5孔引物间的影响无明显变化，当加入量达到1.6 μL时，P3、P4扩增受影响，产量稍降低；当固定引物P3、P4和P5、P6，而增加P1、P2时，P3、P4扩增受影响较明显，而P5、P6扩增受影响较小，1～5孔基本无变化，当达到第6孔时，P5、P6扩增产量才有明显变化。因此该多联PCR反应要注意P1、P2浓度的选择。

图1A　3对引物单项PCR扩增实验结果

图1B　多联PCR引物之间相互影响实验结果

图2　引物间相互影响结果

2.3退火温度优化结果

用温度梯度PCR仪进行PCR扩增，分别选择温度50.3 ℃、51.9 ℃、54 ℃、56.3 ℃、58.3 ℃、59.9 ℃，扩增结果如图3。

图3　退火温度优化结果

由图3可知，在多联PCR反应中，引物P1、P2的扩增在整个温度变化范围内无明显变化；引物P3、P4扩增较适合温度为54 ℃、56.3 ℃；引物P5、P6扩增较适合温度为54 ℃、56.3 ℃。为使三对引物扩增达到最佳效率，平衡三者退火温度，由图3可知，其最佳退火温度为54 ℃。

2.4混合液配制及其反应程序的确定结果

根据上述反应结果确定混合液的配制以及反应程序。多联PCR反应混合液的配制结果：10×ExTaq 聚 合 酶 buffer 2.5 μL，dNTPs（2.5 mmol/L）2 μL，引物P1、P2和P5、P6（20 μmol/L）4 μL（各加1μL），引物P3、P4（20 μmol/L）2.4μL（各加1.2 μL），Ex TaqTMDNA聚合酶0.5 μL，反应体系总体积11.4 μL。多联PCR反应程序的确定结果：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，54℃退火50 s，72 ℃延伸为1.0 min（30个循环），72 ℃延伸10 min进行扩增。

2.5细小病毒多联PCR反应特异性实验优化结果

分别抽提MDWNV、MDPV和GPV的DNA，加入到多联PCR反应体系中，然后PCR扩增，检测其反应的特异性，如图4A、图4B。

由图4A、图4B可知，引物P1、P2能够同时从MDWNV、MDPV和GPV中扩增出目的条带，其他病毒均不能扩增出相应目的条带；引物P3、P4只能从GPV中扩增出目的条带；引物P5、P6只能从MDPV中扩增出目的条带。因此该三对引物都有很高的特异性。

图4A　特异性实验结果

图4B　特异性实验结果

2.6敏感性实验结果

利用核酸蛋白测定仪对MDWNV、MDPV 和GPV的DNA定量后，依次做10倍、100倍和1 000倍稀释，然后进行多联PCR扩增（图5）。由图5可知，该多联PCR检测方法对病毒的检测敏感性达到100 pg。

2.7重复性实验结果

用多联PCR检测方法先后进行3次重复性实验，结果阳性模板均能扩增出相应目的条带，阴性模板则均不能扩增出目的条带，且检测重复率达100%。

2.8稳定性实验结果

将配制好的多联PCR反应混合液置于-20 ℃保存，每隔2个月检测一次，连续4次，结果均能扩增出目的条带，表明该检测方法的稳定性好。

图5　多联PCR敏感性实验结果

图6　人工发病实验结果

图7A　疑似MDP病料临床检测结果

图7B　疑似GP、MDWN临床检测结果

图7C　疑似MDWN临床检测结果

2.9病料组织检测结果

运用多联PCR反应，对具有典型病变、人工发病、具有典型临床症状的病料组织进行检测，结果如下：

2.9.1人工发病实验结果见图6。

2.9.2临床采集病料组织检测结果见图7A、图7B、图7C、图7D。

3　讨论

3.1引物设计

将三对引物同时加入同一反应体系中，进行多联PCR反应。由于不同引物之间的退火温度不同，会造成某一目的基因片段的扩增受到抑制。因此，在设计引物时，不仅要考虑引物退火温度差异不能太大，还要对引物之间的相似性进行分析，以保证反应顺利进行。此外，当扩增的目的片段大小差异较大时，一般优先扩增小的目的片段，后扩增大的目的片段。但如果差别太小，目的片段之间就不利于区分。因此，引物扩增的目的片段不能差别太大，也不能差别太小，一般应保持在100～500 bp之间。在本研究引物设计时，分别选择最保守的、引物之间的相似性较低的地方进行引物设计，所设计出的三对引物扩增目的片段分别为426 bp、290 bp、589 bp，其大小差异都保持100～500 bp之间，因此在凝胶电泳时很容易区分。三对引物在进行多联PCR反应时，引物间相互影响不明显，均能扩增出明显的目的片段，因此判定引物设计合理。

3.2引物之间的相互作用及优化

在研究引物间相互作用的初步实验中，根据其PCR反应结果，发现各目的片段的扩增都比较明显，但引物间的相互影响不明显。为研究引物间相互作用程度，在此基础上，本研究采用了定量其中两对引物浓度，改变第三对引物浓度的方法。结果发现，当引物P3、P4和引物P5、P6浓度增大时，三种PCR扩增产物变化不明显，说明引物P3、P4 或P5、P6浓度的增大不会对其他两对引物产生太大影响；当引物P1、P2浓度增大时，对引物P3、P4扩增产生的影响较大，而对引物P5、P6扩增的影响较小，只有当P1、P2浓度增大到一定程度时，P5、P6扩增产量才有明显变化。因此该多联PCR反应要注意P1、P2浓度的选择。

3.3退火温度的选择

在多联PCR反应中，选择合适退火温度时，应尽最大可能使三对引物都能够达到最大扩增。通过本研究，退火温度变化对引物P3、P4和引物P5、P6扩增反应影响比较大，而对引物P1、P2扩增的影响相对较小。为使三对引物同时达到最大扩增，最佳退火温度为54 ℃。

3.4特异性实验

在本研究中，MDWNV、GPV、MDPV均能扩增出相应的目的片段，而呼肠孤病毒、鸭病毒性肝炎病毒、鸭瘟病毒、大肠杆菌以及阴性对照均未能出现相应目的条带。因此该多联PCR方法特异性强。

3.4敏感性实验

敏感性高的PCR反应，能够快速、准确检测出阳性感染动物；而敏感性低的PCR反应，检测时可能会出现假阴性，不利于疾病的诊断。因此，在建立PCR方法时，一定要注意反应的敏感性。该多联PCR检测方法敏感性强，对病毒的检测下限可达到100 pg。

3.5病料组织检测

将人工发病和送检的、临床上具有典型病变的发病番鸭病料组织进行研磨、离心，将上清液加热，抽提病毒DNA后直接检测，结果均能够检测出相应的目的条带，检出率高达100%。因此，该方法具有很强的实用性，能够直接从临床病料组织中检出病毒，成本低、速度快，无需病原分离纯化。

参考文献：

[1] 季艳菊，张伟，李福伟，等. 雏番鸭细小病毒病快速诊断方法的建立[J]. 水禽世界，2007，（6）：3-5.

[2] 杨建远. 番鸭的一种新病毒性疾病--花肝病[J]. 中国家禽，2005，27（21）：18-19

[3] 胡奇林，陈少莺. 番鸭呼肠孤病毒病（肝白点病）研究进展[J]. 福建畜牧兽医，2004，26（Z1）：7-9.

[4] 胡桂学，逄博，高凤山，等. 小鹅瘟PCR诊断方法的建立和初步应用[J].经济动物学报，2003，7（2）：50-53.

[5] 吴宝成，陈家祥，姚金水. 番鸭呼肠孤病毒B3分离株的致病性研究[J]. 中国预防兽医学报，2001，23（6）：422-425.

（责任编辑：朱迪国）

中图分类号：S851.3

文献标识码：B

文章编号：1005-944X（2016）04-0085-06

DOI：10.3969/j.issn.1005-944X.2016.04.027

通讯作者：王林川

Establishment and Preliminary Application of Multi-PCR for Diagnosis of Three Parvovirus in Muscovy Ducks

Ji Yanju1，Wang Linchuan2
（1. Huizhou Engineering and Technology School，Huizhou，Guangdong 516000；2.South China Agricultural University，Guangzhou，Guangdong 510642）

Abstract：Three pairs of parvovirus generic primers were designed in this paper by using the VP and NS genes respectively from the GPV and MDPV in GenBank and from MDWNV in the Avian Disease Researchers of South China Agricultural University. Furthermore，the single PCR technology to optimize the reaction conditions of multi-PCR was established，such as the concentration of EX-Taq DNA polymerase enzyme，the primer concentration，the dNTPs concentration，the annealing temperature，and so on. The results showed that multi-PCR detection method of three parvovirus in the Muscovy ducks was specifi c，rapid，accurate and sensitive，and could synchronously differentiate three parvo virus of Muscovy ducks.Meanwhile，it could be used for the epidemic materials detection from the clinical typical pathological changes.

Key words：three parvovirus of Muscovy ducks；multi-PCR；establishment；preliminary application