蛇床子素诱导HeLa细胞凋亡的作用机制研究

赵晓娟

南京医科大学附属无锡第二医院妇产科，江苏无锡　214002

蛇床子素诱导HeLa细胞凋亡的作用机制研究

赵晓娟

南京医科大学附属无锡第二医院妇产科，江苏无锡214002

目的研究蛇床子素对人宫颈癌细胞系HeLa细胞的凋亡机制。方法HeLa细胞分别用不同浓度的蛇床子素处理。MTT法检测细胞活力；Hoechst 33342染色观察细胞的形态学变化；流式细胞仪检测细胞凋亡和周期；Western b1ot检测Bc1-2、Bax、caspase-3和caspase-9表达情况。结果蛇床子素浓度为20～120 μg/mL可以剂量和时间依赖性降低HeLa细胞的活力。Hoechst 33342染色显示蛇床子素处理后的HeLa细胞膜通透性增高。流式细胞检测结果显示蛇床子素作用HeLa细胞后可以诱导细胞凋亡，20、40、80 μg/mL蛇床子素处理后细胞凋亡率分别为（21.5±3.6）%、（45.8±5.4）%、（63.6±7.1）%，明显高于0 μg/mL蛇床子素处理的（4.5±1.5）%（P＜0.05）。HeLa细胞经过不同浓度蛇床子素（20、40、80 μg/mL）处理48 h后，G0/G1期细胞比例增加，同时G2/M期与S期细胞比例减少（P＜0.05）。Western b1ot检测结果显示蛇床子素（20、40、80 μg/mL）处理HeLa细胞中C1e-caspase-3、C1ecaspase-9和Bax表达量升高，而Bc1-2表达量降低，且呈剂量依赖性。结论蛇床子素能抑制HeLa细胞的增殖并诱导其凋亡，其作用机制与下调Bc1-2基因的表达、上调Bax基因的表达及增加caspase活性有关。

蛇床子素；宫颈癌；HeLa细胞；Bcl-2家族蛋白

［Abstract］Objective To exp1ore apoptosis mechanism of ostho1e on human cervica1 cancer HeLa ce11s.

Methods HeLa ce11s were treated with ostho1e in different concentration.Re1ative ce11 viabi1ities were determined by the MTT method；Hoechst 33342 staining was used to observe the morpho1ogica1 changes of ce11s；apoptosis and ce11 cyc1e were ana1yzed by f1ow cytometry；the protein expression 1eve1s of Bc1-2，Bax，caspase-3 and caspase-9 were detected by Western b1ot.Results Ostho1e（20-120 μg/mL）significant1y inhibited the viabi1ities of HeLa ce11s in a doseand time-dependent manner.Hoechst 33342 staining showed that the membrane permeabi1ity of ostho1e treated HeLa ce11s increased.F1ow cytometry resu1t showed that ostho1e cou1d induce apoptosis in HeLa ce11s，ce11 apoptotic rate of 20，40，80 μg/mL ostho1e processing was（21.5±3.6）%，（45.8±5.4）%，（63.6±7.1）%respective1y，significant1y higher than that of 0 μg/mL ostho1e processing［（4.5±1.5）%］（P＜0.05）.After different concentrations of ostho1e（20，40，80 μg/mL）processing for 48 h，the proportion of HeLa ce11s in G0/G1phase increased，whi1e the proportion of the G2/M phase and S phase reduced（P＜0.05）.Western b1ot showed that ostho1e（20，40，80 μg/mL）up-regu1ated the expression 1eve1s of C1e-caspase-3，C1e-caspase-9 and Bax，but down-regu1ated Bc1-2，in a dose-dependent manner.Conclusion Ostho1e can inhibit the pro1iferation of HeLa ce11s and promote apoptosis，which may be associated with the down regu1ation of Bc1-2 expression and up regu1ation of Bax expression，as we11 as the increase of re1ative activity of caspase.

［Key words］Ostho1e；Cervica1 cancer；HeLa ce11s；Bc1-2 fami1y protein

宫颈癌是最常见的女性生殖系统恶性肿瘤之一，其死亡率占各类妇科肿瘤的首位［1］。现有化学药品对其的临床疗效并不理想［2］，因此从天然产物中寻找抗癌活性成分是近年来研究的热点［3］。蛇床子素是中药蛇床子的主要活性成分之一，具有广泛的药理活性，包括抗心律失常、解痉、降血压、增强兔疫功能及广谱抗菌作用等［4］。虽然蛇床子素对肿瘤细胞生长的抑制作用曾有文献报道，但其作用机制并未阐明。本研究旨在明确蛇床子素对宫颈癌HeLa细胞活力、凋亡及Bc1-2家族蛋白表达的影响，为揭示蛇床子素的抗肿瘤活性、作用机制以及临床应用前景提供扎实的理论依据。

1　材料与方法

1.1材料

蛇床子素购于Sigma公司；人宫颈癌细胞系HeLa细胞、噻唑蓝（MTT）试剂盒、Bc1-2、Bax抗体购于上海哈灵生物科技有限公司；胎牛血清购于Invitrogen公司；RPMI1640培养液、AnnexinV/PI细胞凋亡检测试剂盒与细胞浆蛋白抽提试剂盒购自上海元龙生物技术有限公司；Hoechst 33342核酸染料购自北京泛博生化有限公司；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（caspase）活性检测试剂盒购于上海华雅思创生物科技有限公司；其他试剂购于北京试剂厂。

1.2方法

1.2.1细胞培养 培养液为含100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素、10%胎牛血清的PMI1640。培养条件：37℃，5%CO2，湿度饱和。取对数生长期细胞用于实验。

1.2.2细胞增殖抑制实验 取1×105/mL的HeLa细胞，接种于96孔板（200 μL/孔），至细胞贴壁后每孔加入终浓度为0、20、40、80、100、120 μg/mL的蛇床子素（样品溶解于DMSO）。各浓度均设5个复孔，继续培养48 h，以同体积PMI1640培养液为空白对照。MTT法检测细胞增殖抑制率按照试剂盒说明书操作。

1.2.3Hoechst 33342染色法检测细胞凋亡 HeLa细胞以1×105/mL的浓度接种于96孔板（200 μL/孔），细胞贴壁后，分别加入终浓度为0、20、40、80 μg/mL的蛇床子素，培养HeLa细胞48 h后，PBS清洗1次，加入4%多聚甲醛室温固定15 min，PBS清洗2次，加入1 mmo1/L Hoechst 33342室温染色15 min，封片，置于荧光显微镜下，选用340 nm的激发光观察。

1.2.4流式细胞术检测细胞凋亡及细胞周期 HeLa细胞以1×106/mL浓度接种于6孔板，待细胞贴壁后加入终浓度分别为0、20、40、80 μg/mL的蛇床子素培养48 h，细胞离心固定后加入Annexin V-FITC和PI，筛网过滤后送流式细胞仪进行细胞凋亡及细胞周期的检测。

1.2.5Western blot检测蛋白表达量的变化 HeLa细胞以1×106/mL浓度接种于6孔培养板内，待细胞贴壁后分别加入蛇床子素，终浓度分别为0、20、40、80 μg/mL，处理48 h后收集细胞，按照试剂盒说明书的方法抽提细胞浆总蛋白并测定浓度。抽提的蛋白样品按常规方法做Western b1ot分析，检测Bc1-2/Bax、caspase-3、caspase-9蛋白表达情况。

1.3统计学方法

采用SPSS 19.0统计软件对数据进行分析和处理，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1蛇床子素对HeLa细胞增殖的影响

不同浓度蛇床子素处理48 h后，均测定细胞活力。如图1所示，蛇床子素在浓度20～120 μg/mL范围内均可显著抑制HeLa细胞活力，且表现出剂量依赖性。

图1　不同浓度蛇床子素处理对HeLa细胞增殖的影响

2.2蛇床子素对HeLa细胞凋亡的影响

Hoechst 33342核酸染料是一种细胞通透性细胞核复染剂，可被活细胞摄取，在与dsDNA结合后激发蓝色荧光。Hoechst 33342染色结果显示，不同浓度蛇床子素处理组的HeLa细胞核浓缩聚集、碎裂，并发出较强的蓝色荧光（图2）。

图2　不同浓度蛇床子素处理对HeLa细胞凋亡的影响（Hoechst 33342染色，200×）

流式细胞仪检测表明蛇床子素能诱导HeLa细胞凋亡。如图3所示，20、40、80 μg/mL蛇床子素处理HeLa细胞48 h后，细胞凋亡率分别为（21.5±3.6）%、（45.8±5.4）%、（63.6±7.1）%，明显高于0 μg/mL蛇床子素的（4.5±1.5）%（P＜0.05），且其作用具有明显剂量依赖性。

2.3蛇床子素对HeLa细胞周期的影响

HeLa细胞经过不同浓度蛇床子素（20、40、80μg/mL）处理48 h后，G0/G1期细胞比例增加，同时G2/M期与S期细胞比例减少，说明蛇床子素使HeLa细胞周期阻滞在G0/G1期，正常的细胞增殖周期被抑制。见表1。

表1　不同浓度蛇床子素处理后HeLa细胞周期变化（%）

2.4蛇床子素对HeLa细胞Bax、Bcl-2、caspase-3、caspase-9表达量的影响

图4所示，蛇床子素处理HeLa细胞48 h后，随着蛇床子素浓度的升高，Bax的表达量依次升高，而Bc1-2的表达量降低；未使用蛇床子素处理的HeLa细胞C1e-caspase-3、C1e-caspase-9几乎没有表达，而经过蛇床子素（20、40、80 μg/mL）处理48h后，HeLa细胞C1e-caspase-3、C1e-caspase-9表达量呈浓度依赖性增加。

图3　流式细胞术Annexin V-FITC和PI双染色显示蛇床子素诱导细胞凋亡

图4　蛇床子素对HeLa细胞Bax、Bcl-2、caspase-3、caspase-9表达量的影响

3　讨论

中医药除了有取材方便、价格低廉和毒副作用低等优点外，在减轻临床症状、提高生存质量、防止复发转移、延长生存期、提高兔疫力、增强放化疗敏感性、减轻放化疗不良反应等方面均具有优势。近年来中药及其有效部位或成分抗癌研究工作取得了一系列的成果。对蛇床子中化学成分研究主要集中在香豆素类化合物上，如蛇床子素、佛手柑内酯、异虎耳草素、花椒毒酚、花椒毒素、欧芹属素乙等。其中蛇床子素又名甲氧基欧芹酚或欧芹酚甲醚，是天然香豆素类化合物，是蛇床子中含量最大的化合物。蛇床子素具有广泛的药理活性，如对中枢神经系统具有镇静作用；对心血管系统具有抗心律失常作用、扩张血管作用等；对内分泌系统具有拮抗激素引起的骨质疏松作用等。此外，蛇床子素还具有抗菌、抗炎、抗病毒、抗肝损伤、抗氧化、抗衰老等作用［5-6］。

蛇床子素的体外抗肿瘤活性研究在国外报道较早，20世纪90年代有学者首先报道了蛇床子素通过抑制黄嘌呤氧化酶进而表现出抗癌活性；有学者还报道了蛇床子素对胃腺癌细胞、人宫颈癌细胞有明显的抑制活性［7-11］。近年来，又有学者陆续报道了蛇床子素可以诱导骨肉瘤细胞、结肠腺癌细胞、乳腺癌细胞及肺癌细胞凋亡［12-15］。但是蛇床子素对肿瘤细胞作用的具体机制尚不清楚。

细胞凋亡是多细胞机体维持内环境稳定的重要自我调节机制，诱导细胞凋亡是评估抗癌药物效力的重要指标之一［16-17］。本研究发现，蛇床子素在20～120 μg/mL浓度范围均能抑制人宫颈癌HeLa细胞的增殖，量效关系及时效关系明显。蛇床子素处理HeLa细胞48 h后可诱导凋亡，且量效关系明显。

caspase家族蛋白的激活被公认为是诱发凋亡的直接效应物。本研究发现，蛇床子素呈浓度依赖性增加HeLa细胞中caspase-3和caspase-9的活性形式C1e-caspase-3和C1e-caspase-9的表达量，提示蛇床子素可能通过增强细胞caspase活性来抑制细胞增殖，并促进细胞凋亡。

Bc1-2蛋白家族是一个特殊的蛋白家族，其中有一些可以促进细胞凋亡，如Bad、Bid、Bax，有些则可以阻止细胞产生凋亡，如Bc1-2、Bc1-w。Bc1-2能够阻止细胞色素C从线粒体释放到细胞质，从而抑制细胞凋亡。Bc1-2是一种内膜蛋白，主要存在于线粒体、内质网和核膜上，它在多种肿瘤细胞中表达，能通过增强线粒体膜电位，抑制钙离子释放，阻止核酸内切酶活化，进而发挥抗凋亡作用；Bax的作用与Bc1-2相反，可直接激活细胞凋亡效应因子caspase或改变细胞膜通透性引起细胞色素C释放某些离子和小分子通过细胞膜，进而促进细胞凋亡。细胞Bc1-2和Bax比例改变可调节细胞凋亡，当Bc1-2占优势时，细胞具有抗凋亡作用；相反，当Bax过表达时，细胞易发生凋亡［18-20］。本研究发现，经过蛇床子素处理48 h后，抗凋亡蛋白Bc1-2表达下调，而促凋亡蛋白Bax表达上调，因此Bc1-2与Bax的比值增加，这与蛇床子素的凋亡作用呈正相关。这说明蛇床子素作用于肿瘤细胞后，通过调控Bc1-2家族蛋白而引起促凋亡蛋白表达量上调，抗凋亡蛋白表达量下调，进而发挥促进细胞凋亡的作用。由于蛇床子素具有广泛的生物学作用，其对肿瘤细胞的作用可能并非针对单一靶点，因此对蛇床子素诱导HeLa细胞凋亡机制的进一步研究以及阻滞细胞传导通路、信使的相关研究，将对其临床应用具有较好的指导意义。

综上所述，蛇床子素能抑制HeLa细胞增殖并诱导细胞凋亡，量效关系明显，作用机制可能是通过上调Bax蛋白表达并下调Bc1-2蛋白表达，增加细胞caspase-3和caspase-9活性。本研究为宫颈癌治疗先导化合物的发现提供了新的线索。

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Study on effect mechanism of HeLa cells apoptosis induced by osthole

ZHAO Xiaojuan
Department of Gynaeco1ogy and Obstetrics，Wuxi No.2 Peop1e's Hospita1 Affi1iated to Nanjing Medicia1 University，Jiangsu Province，Wuxi214002，China

R737.33

A

1673-7210（2016）04（c）-0032-04

2016-01-19本文编辑：李亚聪）