一株锶高效富集真菌的筛选、鉴定及富集特性

卢 红，赖金龙，刘 聪，付 倩，吴 国，陶宗娅

(四川师范大学生命科学学院，四川成都610101)

一株锶高效富集真菌的筛选、鉴定及富集特性

卢 红，赖金龙，刘 聪，付 倩，吴 国，陶宗娅*

(四川师范大学生命科学学院，四川成都610101)

为利用微生物技术修复环境中的锶(Sr)污染，通过从锶污染的土壤中分离、筛选Sr的高效富集菌种，采用响应曲面法优化该菌对Sr的富集条件．结果显示，通过富集培养、稀释平板涂布筛选出一株对Sr具有较强富集能力的真菌，经鉴定该菌为Talaromyces sp．．利用响应曲面法优化后，各因素的最佳水平组合为:培养温度35℃，pH值3．0，Sr初始质量浓度50 mg/L，该菌(干重)对Sr的富集量达到1 815．21 mg/kg，优化后的富集量与理论预测值较接近，说明响应曲面法建立的模型可用于预测该菌对Sr2+的富集特性．结果表明，筛选得到的Talaromyces sp．对Sr的富集能力强，可用于环境中的Sr污染修复．

锶;真菌;富集;响应曲面法

随着核工业、核技术的发展与广泛应用，它们在给人类带来巨大社会经济效益的同时，也产生了大量放射性废物排入环境中形成放射性污染［1］．这些放射性废物包括90Sr、54Mn、55Fe、60Co、63Ni、129I、134Cs、234U等［2］．其中90Sr作为主要的放射性核废物，其化学性质与Ca2+相似，具有半衰期长(28．9 a)、危害性大等特点［3］，使90Sr极易通过食物链进入动物或人体内，替换骨骼中的Ca2+，形成内辐射，导致血细胞、骨细胞和皮肤细胞大量死亡，对健康带来危害．因此，放射性Sr2+的环境生物学效应已受到广泛关注［4－6］．

近年来，利用生物修复技术清除土壤中放射性核素的应用研究已取得一些成果，如利用植物修复技术，在90Sr的污染区种植超富集植物(如向日葵、粗根大戟、毛蕊花和黄耆)，通过此类植物的吸收和富集以达到清除土壤中的90Sr，修复效果较好［7－9］．然而，利用植物修复技术治理水中的90Sr污染存在一定局限，目前研究显示，采用微生物修复技术吸收溶液中的90Sr，如固定化的耐辐射奇球菌［10］、啤酒酵母［11］等微生物对Sr的吸收率最高可达98%，表明该技术的修复效果理想．同时，该技术具有投入低，操作简便，无二次污染等优点，应用范围已越来越广［12－13］．但现阶段，筛选出的耐受性强、吸收效果好的微生物菌种仍较为缺乏，在一定程度上限制了该技术的应用．因此，本研究拟从88Sr污染的盆栽土壤中分离筛选Sr2+的高效富集菌，并通过单因素富集优化实验及响应曲面法提供菌株对Sr2+的富集能力，旨在为环境修复治理中微生物资源的高效利用提供实验依据和新的菌株资源．

1 材料与方法

1．1 主要仪器设备 原子吸收分光光度计(TAS－990，北京普析通用仪器有限责任公司);PCR仪(S1000，美国伯乐公司);琼脂糖水平电泳槽(DYCP 31DN型，北京泽兰西科技有限公司);稳压电泳仪(DYY－6C型，南京科弋创生物科技有限公司);凝胶成像分析系统(Gel Doc XR+，美国伯乐公司);酸度计(PHS－4C+，深圳市三利化学品有限公司);立式压力蒸汽灭菌器(LDZX－50FBS，上海申安医疗器械厂);电热恒温鼓风干燥箱(DHG－9245A，上海金璃仪器设备有限公司);天平(精度0．001g);恒温摇床(DHZ－CA，上海市百典仪器厂);1～10 μL、10～100 μL、100～1 000 μL移液器及枪头;超净工作台;水浴恒温震荡仪等．

1．2 培养基及主要成分 液体无机盐培养基: CaCO30．5 g，K2HPO42．0 g，(NH4)2SO41．0 g，MgSO4·7H2O 0．5 g，NaCl 0．1 g，SrCl 20．01 g，酵母膏0．5 g，蔗糖10．0 g，质量浓度为 870 mg/L的Sr2+，蒸馏水1 L．马丁培养基(筛选培养基):蛋白胨5 g，KH2PO41 g，MgSO4·7H2O 0．5 g，葡萄糖10 g，琼脂18 g，10 g/L孟加拉红溶液3．3 mL，10 g/L链霉素0．3 mL，不同质量浓度的Sr2+，蒸馏水1 L．

富集培养基(液体培养基):CaCO30．5 g，K2HPO42．0 g，(NH4)2SO41．0 g，MgSO4·7H2O 0．5 g，NaCl 0．1 g，酵母膏0．5 g，蔗糖10．0 g，不同质量浓度的Sr2+，蒸馏水1 L．所有化学试剂均为分析纯．

1．3 抗性真菌的分离纯化 选用的土壤是本研究室模拟Sr2+污染的盆栽土壤，该盆栽土壤已栽种一季印度芥菜，土壤质地为:壤土，其理化性质如表1所示．其中，Sr2+的污染水平为870 mg/kg，是我国土壤背景值的5倍(目前我国土壤中Sr2+的背景值平均水平为167 mg/kg)［14］，属于Sr2+的重度污染土壤．

表1 土壤样本的理化性质Table 1 The physical and chemical properties of tested pot－soil samples

样品采样及预处理:去除表层土3 cm，避免地面微生物与土样混合，再采用多点混合采样法．将土样装入保鲜袋中，自然风干后，过2 mm筛除去植物残渣，过筛土样装入保鲜袋于4℃保存．

称取2．000 g土样，接种至100 mL液体无机盐培养基中，于28℃，150 r/min恒温震荡培养6 d，将处理后的土壤悬液静置10 min后，吸取1．0 mL上清液，转接至新鲜的液体无机盐培养基中，继续富集培养6 d．

分离纯化:富集培养后，吸取0．1 mL菌悬液，梯度稀释至10－1～10－6，分别涂布到马丁固体培养基上，28℃倒置培养6 d后，挑选单菌落，反复划线纯化并镜检，纯化的菌株保藏于斜面培养基中．

1．4 高效富集菌的筛选 将分离纯化后得到的抗性菌株分别接种到ρ(Sr2+)为350 mg/L富集培养基中，于28℃，150 r/min恒温震荡培养6 d后，4 500 r/ min离心10 min，弃上清液，沉淀中加入20 mmol/L EDTA－Na210 mL离心10 min，弃上清液，沉淀中再加入10 mL蒸馏水离心10 min，弃上清液，取沉淀烘干至恒重，加入消解液(硝酸∶高氯酸的体积比为3∶1)，消解澄清后，定容，原子吸收分光光度计(TAS－990，北京普析)测定Sr2+含量，分析比较各菌株对Sr2+的富集能力，筛选出高效富集菌株．

1．5 高效富集菌的抗性及分子鉴定 将筛选出的高效富集菌接种至ρ(Sr2+)为1 000 mg/L马丁培养基中，28℃倒置培养6 d后，观察菌株生长情况．

真菌ITS鉴定:采用植物总DNA提取试剂盒(北京康为世纪生物科技有限公司)提取菌株总DNA后，扩增真菌ITS序列．送样测序(成都擎科梓熙生物技术有限公司完成)．将基因序列提交至GenBank数据库，利用BLAST将菌株的基因序列与GenBank数据库中已登录的基因序列进行对比，采用Neighbor Joining法构建系统发育树．

1．6 抗性菌株对Sr2+富集效果的单因素条件优化优化实验采用三因素三水平全组合实验，见表2．将1 mL菌悬液接种至灭菌后的ρ(Sr2+)100 mg/L富集培养基中，在相应的培养温度、初始浓度和pH值条件下，150 r/min恒温震荡培养6 d后，参照1．4，测定菌株对Sr2+的富集量．

表2 实验因素和水平Table 2 The experimental factors and levels

1．7 响应曲面法优化菌株对Sr2+的富集效果依据单因素实验结果，挑选富集效果最佳的单因素范围，利用Design－Expert 8．0．6 Trial软件对富集条件进行优化，实验设计如表2所示．将1 mL菌悬液接种至灭菌后的各富集培养基中，依据实验设计需设置的培养条件，于150 r/min恒温震荡培养6 d后，参照1．4，测定菌株对Sr2+的富集量．

1．8 数据分析与处理 采用SPSS 18．0对数据进行方差分析，Duncan法多重比较，Origin 9．0作图．

2 结果与分析

2．1 高效富集菌的筛选及鉴定 经过富集培养后，从土壤中共分离纯化得到10株对Sr2+具有抗性的真菌，对其进行二次筛选，即筛选出高效富集菌株．结果显示，当富集培养基中ρ(Sr2+)为350 mg/L时，富集培养6 d后，菌株B3富集Sr2+的能力最强，达到28．78 mg/g，显著高于其他菌株的Sr2+富集量(P＜0．05)(图1)．抗性实验显示，当ρ(Sr2+)为1 000 mg/L时(图2，II)，菌株B3单菌落的形态结构与ρ(Sr2+)0 mg/L无明显的差异(图2，I)．将菌株B3的ITS序列在NCBI上进行blast检索比较，通过MEGA6．0软件，采用N－J法构建系统发育树，结果如图3所示．结果表明，B3与Talaromyces的基因序列具有100%的同源性，因此，鉴定B3为Talaromyces sp．．

2．2 B3对Sr2+富集效果的优化 培养温度:当富集培养基中ρ(Sr2+)为100 mg/L时，随着培养温度升高(20～40℃)，B3对Sr2+的富集量呈先升后降的趋势;当温度为35℃，富集量显著高于其他温度培养组(P＜0．05)，达到725．43 mg/kg(图4(A))．因此，B3富集Sr2+的最佳培养温度为35℃．

pH:当培养温度为28℃，Sr2+初始质量浓度为100 mg/L时，随着培养基pH值增加(pH 3～8)，B3对Sr2+的富集量呈现先升后降的趋势;当pH值为4时，B3对Sr2+的富集量显著高于其他处理组(P＜0．05)，富集量达到1 556．76 mg/kg(图4(B))．因此，B3富集Sr2+的最佳pH值为4．

Sr2+初始质量浓度:当培养温度为28℃，随着富集培养基中Sr2+初始质量浓度提高到50 mg/L，B3对Sr2+的富集量呈先升后降的趋势;当ρ(Sr2+)为40 mg/L时，B3对Sr2+的富集量显著高于其他Sr2+初始质量浓度组(P＜0．05)，达到1 535．22 mg/kg(图4(C))．因此，B3富集Sr2+的最佳初始质量浓度为40 mg/L．

2．3 响应曲面法优化富集效果 根据单因素优化结果，即最佳培养温度(A)35℃、最佳Sr2+初始质量浓度(B)mg/L、最佳pH值(C)4时，采用响应曲面法，对B3的富集效果进行优化，确定最佳富集条件，结果如表3所示．利用Design Expert 8．0．6 Trial软件对表3数据进行统计分析，选择Quadratic模型对数据进行多元回归拟合，得到多元回归模型:

经检验，回归模型显著(P＜0．01)，模型确定系数为R2=0．909 3，表明此模型能解释90．93%的响应值变化，与实际实验拟合程度较好．模型失拟性分析显示，失拟性不显著(P＞0．05)，表明所拟合的回归方程在整个回归区域内拟合度较好，符合实验要求，可用该回归模型对Sr2+富集量进行估算(表4)．各参数(A、B、C)显著性检验显示，该模型一次项参数B影响极显著(P＜0．01)，参数C影响显著(P＜0．05)，参数A影响不显著(P＞0．05);交互项AB，AC，BC和二次项 A2、B2、C2均不显著(P＞0．05)(表5)．依据回归模型，利用Origin 9．0软件建立矩阵，绘制3D响应曲面图．结果显示，当pH值固定为4时，随着Sr2+初始质量浓度增加，B3对Sr2+的富集量先升后降;随着培养温度增加，富集量逐渐上升;当培养温度为35℃、初始质量浓度为48．06 mg/L时，富集量最大，达到1 006．47 mg/kg (图5)．当浓度固定为40 mg/L时，随着培养温度升高和pH值降低，B3对Sr2+的富集量逐渐增加，当培养温度为35℃、pH值为3．0时，富集量最大，达到1 531．09 mg/kg(图6)．当培养温度固定为35℃时，随着Sr2+初始质量浓度增加，富集量呈现先升后降的趋势;随着pH值提高，富集量逐渐降低．当Sr2+初始质量浓度为49．032 mg/L，pH值为3．0时，Sr2+富集量最大，达到1 230．59 mg/kg(图7)．

经Design Expert 8．0．6 Trial软件分析，得到B3富集Sr2+的最优条件为:培养温度35℃，Sr2+初始质量浓度49．69 mg/L，pH值3．0时，B3对Sr2+富集量的理论值为1 715．17 mg/kg．

模型验证:考虑到实际操作的可行性，将模拟得到的最佳富集条件调整为:温度35℃，Sr2+初始质量浓度50 mg/L，pH值3．0．在此条件下进行验证实验，实测3次平行试验的平均富集量为1 815．21 mg/kg，与模型理论预测值1 715．17 mg/kg相差不大，表明该模型预测性好，利用响应曲面法优化富集条件具有一定的可靠性．

3 讨论

近年来，利用细菌类、真菌类以及藻类作为生物吸附剂处理放射性核素已取得一定研究成果，如筛选出的耐辐射奇球菌对 辐照耐受性强，对铀(U)、锶(Sr)具有较强的富集能力［15－16］;以废弃啤酒酵母作为生物吸附剂，啤酒酵母菌对Sr的理论饱和吸附量可达到29．67 mg/g［17］．采用固定化技术，通过海藻酸钠(SA)及聚乙烯醇(PVA)－SA固定化载体包埋、固定耐辐射奇球菌，对Sr吸附率最高达到98%左右［10］．本文通过将高浓度 Sr(10 mmol/kg)添加到土壤中，通过模拟Sr污染环境，经过长期驯化后，从土壤中分离得到一株锶高效富集真菌Talaromyces sp．，该菌株与已有报道的耐受性菌株(如:啤酒酵母、耐辐射奇球菌、面包酵母、枯草芽孢杆)具有类似特性［18］，具有富集量大，耐受性强等特点．通过优化实验，其富集能力最高可达到115．21 mg/kg，活菌的富集能力较强．

表3 BOX－Behnken实验设计及结果Table 3 BOX－Behnken design and the experimental results

表4 二次回归模型方差分析结果Table 4 Analysis of variance(ANOVA)results of the second－order regression model

表5 回归方程系数显著性检验Table 5 Regression coefficient and their significance for the quadratic polynomial model

已有研究表明，活菌对核素(如:铀)的吸收方式主要包括细胞壁结合和胞内富集两条途径［18］，如微生物的细胞壁主要由多聚糖构成，可有效阻滞、结合重金属［19］;假单胞菌属、硫杆菌属微生物可通过自身代谢过程将铀富集于细胞内［18］．本文筛选出的Talaromyces sp．，属于黄丝曲霉属真菌，其细胞壁主要含有几丁质、甘露聚糖及糖蛋白等［20］，这些多聚糖可与细胞膜结合，结合后的蛋白中含有许多活性基团，如:羧基、磷酸基、氨基和羟基［21－22］，能与 Sr共价结合、络合后，固定在细胞壁．同时，依赖于细胞膜转运系统，通过自身代谢过程也可将部分Sr富集到细胞内．

综上，本研究筛选出一株对Sr富集能力很强的真菌，经鉴定，菌种为Talaromyces sp．．根据单因素条件优化、响应曲面法建立模型以及模型验证，得到该菌对Sr2+的最佳富集条件为:培养温度35℃，pH值3．0，Sr2+初始质量浓度50 mg/L，其对Sr2+的富集量可达到1 815．21 mg/kg．优化后的实际富集量与理论预测值较接近，表明响应曲面法建立的模型可用于预测该菌对Sr2+富集特性．然而，较多研究者认为微生物死细胞的吸附行为与细胞本身的新陈代谢没有关系，对核素具有更好的吸附力［23］．因此，后续将以该菌为生物吸附剂，验证死细胞对Sr2+的吸附能力．

致谢 四川师范大学校级青年项目(14QN07);四川师范大学重点培育项目(ZP1609);四川省生物质改性材料工程技术研究中心开放课题(12ZXBK03)对本文给予了资助，谨致谢意．

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A Research on the Screening，Identification，and Enrichment Characteristics of a Fungi Strain with Efficient Enrichment to Strontium

LU Hong，LAI Jinlong，LIU Cong，FU Qian，WU Guo，TAO Zongya

(College of Life Science，Sichuan Normal University，Chengdu 610101，Sichuan)

In order to use microorganism removing environment of strontium，this paper obtained an efficient enrichment of fungi strain by screening of microorganisms from Sr2+polluted soil．Meanwhile，Sr enrichment conditions of the fungi strain was optimized by using response surface method．The results showed a fungi strain has obtained，which has efficient enrichment ability for Sr，identifying as Talaromyces sp．．After the optimizing by response surface method，the best combination of various factors was:a culture temperature of 35℃，a pH value of 3 and a initial concentration of 50 mg/L，the enrichment value was up to 1815．21 mg/kg，which was closed to the prediction．It showed that the model established from response surface method can be used to predict the fungus enrichment characteristics of Sr2+．In general，Talaromyces sp．had stronger capacity of enriching Sr，it should have a great application potential to remove environment of strontium．

strontium;fungi;enrichment;response surface method

Q939．96

A

1001－8395(2016)04－0581－07

10．3969/j．issn．1001－8395．2016．04．023

(编辑 陶志宁)

2015－07－17

四川省教育厅自然科学重点课题(14ZA0030)

*通信作者简介:陶宗娅(1957—)，女，教授，主要从事植物逆境生物化学与分子生物学方面的研究，E－mail:t89807596@163．com