生防菌XM—10培养基的优化

唐蕊+张雪辉+徐立实

摘要：针对从土壤中筛选出的抑菌谱较广的生防菌XM-10进行了培养基的优化研究，旨在为其应用于现代农业进行生物防治药剂的开发生产奠定基础。采用单因素和正交试验相结合的方法，主要对培养基中的碳源、氮源和初始pH值进行了优化。结果表明：在供试的材料中，培养生防菌XM-10的最佳碳源是全麦粉，最佳氮源是大豆粉，最佳初始pH值是8.5，即其最优的培养基配方是全麦粉30 g、大豆粉11 g、K2HPO4·3H2O 0.5 g、MgSO4 0.5 g、FeSO4 001 g、NaCl 0.5 g、水 1 000 mL，初始pH值 8.5。

关键词：生防菌；培养基；正交试验；碳源；氮源

中图分类号： S476.1文献标志码： A文章编号：1002-1302（2016）06-0215-02

收稿日期：2015-05-08

基金项目：河北省高等学校科学技术研究青年基金（编号：QN2014323）。

作者简介：唐蕊（1976—），女，河北秦皇岛人，硕士，教授，从事微生物教学与研究工作。E-mail：xtxytr@126.com。随着人们环保意识的加强，对生态环境的保护日益重视，现代农业成为当今农业发展的主流，对农产品质量提出了更高的要求，由于植物病害的生物防治具有安全、无残留、无污染等优点，已成为重要的防治手段。而其中利用生防菌对植物病害进行生物防治研究是当前的一大热点，并且一些抑菌效果显著的生防菌已经开发应用于农业生产。如美国用于防治大豆、麦类、棉花等作物多种病害的有4株枯草芽孢杆菌获得环保局商品化或有限商品化生产应用许可[1]；德国开发了用于防治莴苣的核盘菌菌核病的商品制剂ContansWG[2]；意大利研制了用于防治镰刀菌属病害的Biofox C[2]；澳大利亚开发了用于防治麦类和胡萝卜等作物土传病害的枯草芽孢杆菌A-13[3]；南京农业大学研发了用来防治小麦纹枯病的“麦丰宁”[4]和用于防治白菜软腐病的“菜丰宁”[5]，中国农业大学和云南农业大学合作研发了对小麦、白菜、烟草等作物的土传病害均有良好防治效果的“百抗”[6]等。本试验针对从土壤中筛选出的抑菌谱较广的生防菌XM-10进行了培养基的优化研究[7]，旨在为其应用于现代农业进行生物防治药剂的开发生产奠定基础。

1材料与方法

1.1材料

生防菌XM-10（邢台学院微生物实验室分离保存）。

1.2方法

1.2.1碳源的筛选以高氏1号液体培养基为基础，分别以15、20、25、30 g/L不同的单一碳源（葡萄糖、蔗糖、玉米粉和全麦粉[8]）和混合碳源[9]（葡萄糖+玉米粉、葡萄糖+全麦粉，其中葡萄糖含量设置为2 g/L）代替高氏一号液体培养基中的碳源（20 g/L可溶性淀粉），其他成分不变，设3个重复，在相同培养条件下，摇瓶发酵培养5 d后，测定菌体干质量。

1.2.2氮源的筛选以最佳碳源为基础，以硫酸铵、硝酸钠、大豆粉和蛋白胨[8-9]代替高氏一号液体培养基中的氮源（硝酸钾1.0 g/L），浓度如表1，其他成分不变，设3个重复，在相同培养条件下，摇瓶发酵培养5 d后，测定菌体干质量。

表1不同氮源梯度设置

水平

梯度（g/L）

硫酸铵硝酸钠蛋白胨大豆粉

10.50.53.03.0

21.01.05.05.0

31.51.57.07.0

42.02.09.09.0

1.2.3初始pH值采用高氏一号液体培养基，在其他培养条件不变的情况下，将培养液初始pH值分别调至3.0、5.0、7.0、9.0、11.0，设3个重复，摇瓶发酵培养5 d后，测定菌体干质量。

1.2.4正交试验根据单因素试验结果选取碳源、氮源、pH值3因素设置3个水平（表2），选择正交表L9（34），进行液体菌种培养基优化试验。摇瓶发酵培养5 d后，测定菌体干质量。

2结果与分析

2.1碳源的筛选

在不同的碳源条件下，生防菌XM-10的生长状况不同。由图1可见，生防菌XM-10在蔗糖中生长量最低，而在全麦粉中，在不同浓度下，其菌体生长量水平均高于其他几种碳源，由此可知全麦粉对生防菌XM-10生长最有利。由于全麦粉在图1中菌体干质量呈增长趋势，为找出其最高点，增设35、40 g/L这2个梯度重复试验，结果见图2。从图2可以得知生防菌XM-10在全麦粉添加量为 30 g/L 时，菌体生长量最大，为19.104 mg/mL，故30 g/L为全麦粉添加量的最佳值。

2.2氮源的筛选

在不同的氮源条件下，生防菌XM-10的生长状况差异显著。由图3可知，生防菌XM-10在硫酸铵和硝酸钠中生长量较低，且曲线比较平缓，在蛋白胨和大豆粉中，随着浓度3～7 g/L时其生长量呈直线增长，7～9 g/L时增长趋势不明显，但在各浓度下，在大豆粉中的菌体生长量均高于蛋白胨，由此可知在上述几种氮源中，大豆粉对生防菌XM-10生长最有利。由于随着大豆粉浓度增大菌体干质量呈增长趋势，为找出其最高点，增设11、13 g/L重复试验，结果见图4。从图4可以得知在大豆粉添加量为7～9 g/L时，菌体生长量有一定的增幅，而由9 g/L增至11g/L和13 g/L时，菌体生长量基本持平，甚至呈现略微下降趋势，故得出9 g/L为大豆粉添加量的最佳值。

2.3初始pH值

在不同初始pH值条件下培养5 d后，测量各组菌体干质量。由图5可知，当pH值为3.0～9.0时菌体生长量呈增上升趋势，当pH值为9.0～11.0时菌体生长量呈下降趋势，pH 值9.0为最大值。在此基础上，设置7.0、7.5、80、8.5、9.0、9.5几种pH值（图6），当pH值为8.0时菌体生长量为最大，故其培养基初始pH值最佳为8.0。

2.4正交试验

根据正交表L9（34），将表中各因素水平的试验结果进行处理分析（表3），通过计算极差的方法确定最佳发酵培养基的配方。极差越大，该因子对试验结果的影响越大，从而可以按极差的大小来决定因子的主次顺序。由表3的极差分析可看出，本试验配方因子的主次顺序是全麦粉（碳源）>大豆粉（氮源）>初始pH值。通过k值对比可知，全麦粉（碳源）的k2水平最佳，为30 g/L，大豆粉（氮源）的k3水平最佳，为110 g/L，培养基初始pH值的k3水平最佳，为8.5。故依据上述正交试验结果得出的最佳配方为全麦粉30 g/L、大豆粉11.0 g/L、初始pH值为8.5。

3讨论

生防菌既可在植物和其根际定植生长，形成生物屏障，保护作物免受病原菌侵害，亦可修复土壤生物多样性，成为当今研究和开发的热点[10]。同时应用生防菌的活体制剂，会避免由于单一大量使用抗生素造成的诸如破坏自然界微生物的平衡、造成自然选择压力等弊端，应用前景较为广阔。通过培养原料的选择和培养基质的优化，改进发酵生产技术，可以有效降低生产成本，提高生物活体制剂的生产效率，使其具有更加

广阔的市场前景[11]。生防菌XM-10可以抑制多种植物病原菌，具有较为广泛的抑菌谱[7]，有希望开发成广谱的活体制剂。但需在其田间的定殖能力、抗药能力、菌种稳定性等方面做进一步的研究，为该菌株开发为安全、有效、环境友好型的生物活体制剂打下坚实的基础。

参考文献：

[1]翟茹环. 枯草芽孢杆菌G8抗菌物质的理化性质分析及分离纯化[D]. 泰安：山东农业大学，2008.

[2]胡燕梅，杨龙. 利用微生物防治植物病害的研究进展[J]. 中国生物防治，2006（增刊1）：190-193.

[3]Baker K F. Evolving concepts of biological control of plant pathogens[J]. Annual Review of Phytopathology，1987，25：67-85.

[4]惠明，窦丽娜，田青，等. 枯草芽孢杆菌的应用研究进展[J]. 安徽农业科学，2008，36（27）：11623-11624，11627.

[5]王金生. 细菌素在植物细菌病害生防中的应用[J]. 生物防治通报，1985，1（2）：36-40.

[6]彭灯水. 枯草芽孢杆菌12-041和12-059对玉米纹枯病生物防治的研究[D]. 雅安：四川农业大学，2009.

[7]张雪辉，唐蕊，徐立实，等. 生防菌XM-10抑菌活性的测试及鉴定[J]. 吉林农业科学，2014，39（4）：39-42.

[8]夏觅真，蒋颂，罗薇薇，等. 土壤放线菌FX05发酵培养基及发酵条件的优化[J]. 微生物学杂志，2009，29（4）：49-52.

[9]陈丽红，惠友为. 链霉菌NW136菌株发酵条件的研究[J]. 陕西林业科技，2008（1）：1-3.

[10]赵晓宇，孟利强，沙长青. 生防菌防治土传真菌病害现状及抗性物质的研究进展[J]. 国土与自然资源研究，2013（5）：95-96.

[11]姜钰，董怀玉，徐秀德，等. 放线菌在植物生防中的研究进展[J]. 杂粮作物，2005，25（5）：329-331.