新型吲哚类衍生物对人胃癌MGC-803细胞增殖的影响

滕玉鸥，赵红叶，周 瑶，韩开林，陆 斌，孙 华（天津科技大学生物工程学院，天津 300457）

新型吲哚类衍生物对人胃癌MGC-803细胞增殖的影响

滕玉鸥，赵红叶，周 瑶，韩开林，陆 斌，孙 华
（天津科技大学生物工程学院，天津 300457）

为了深入研究吲哚类衍生物对胃癌细胞增殖的作用及其机制，本文研究了19种吲哚类衍生物对人胃癌MGC-803细胞增殖的抑制作用并进行了构效关系分析，最终筛选出结构全新且具有明显抗肿瘤活性的候选化合物16. 进一步的研究发现：化合物16能诱导MGC-803细胞发生G2/M期阻滞；同时，Annexin V/PI双染的结果表明化合物16能诱导MGC-803细胞的凋亡.

吲哚类衍生物；细胞增殖；细胞凋亡

吲哚类衍生物具有广泛的生物活性，如抗癌、抗抑郁、抗惊厥、抗真菌、抗HIV及消炎等［1］.在过去的几十年中，越来越多的工业界和学术界研究人员已着手开发新的吲哚类抗癌药物［2］.2006年FDA批准的用于治疗胃肠道间质肿瘤和晚期肾细胞癌的化疗药舒尼替尼（Sutent）即为吲哚类衍生物.本课题组在前期工作中合成了一系列新型吲哚类衍生物，并对其抑制人白血病细胞K562的增殖作用进行了初步研究［3-4］.

胃癌近年来呈现高发病率和高致死率的趋势，在世界范围内发病率仅次于肺癌，位居第二位.每年胃癌发病率约为万分之六，死亡率约为万分之三，居恶性肿瘤死亡第一位［5］.本文以人胃癌MGC-803细胞为实验对象，研究了吲哚类衍生物对胃癌细胞增殖的影响及其初步的作用机制.首先通过MTT法［6］对19种化合物的抗肿瘤活性进行测试，通过构效关系分析筛选出具有明显抗肿瘤活性的候选化合物.然后观察候选化合物对胃癌MGC-803细胞形态学的影响，并应用流式细胞技术检测候选化合物对MGC-803细胞周期及凋亡的影响，从而阐明候选化合物抑制MGC-803细胞增殖的初步作用机制.深入研究吲哚类衍生物对胃癌细胞增殖的作用及其机制，对扩展该类化合物的抗肿瘤谱及日后开发新型吲哚类抗癌药物具有重要意义.

1 材料与方法

1.1 细胞株与细胞培养

人胃癌细胞MGC-803（天津科技大学生物工程学院药物设计与合成研究室保存）用体积分数为10%，胎牛血清的DMEM培养基，置于37，℃、5%，CO2恒温培养箱中培养.取对数生长期细胞用于实验.吲哚类衍生物加入培养基前均用二甲基亚砜（DMSO）溶解.

1.2 试剂与仪器

PRMI-1640细胞培养液、巴西胎牛血清、0.25%，胰蛋白酶（1×）溶液、青霉素-链霉素溶液，赛默飞世尔科技公司；MTT、RNase A，北京索莱宝科技有限公司；乙醇（分析纯），国药集团化学试剂有限公司；喜树碱（分析纯），北京偶合科技有限公司；二甲基亚砜，美国Amresco公司；Annexin V-FITC 凋亡试剂盒，美国BD公司；碘化丙啶（PI），西格玛奥德里奇中国有限公司；本实验使用的吲哚类衍生物由天津科技大学生物工程学院药物设计与合成研究室成员韩开林等人合成.

TX323L型电子分析天平，岛津国际贸易有限公司；Model 3100 series型CO2培养箱、MULTISKAN MK3型基础酶标仪，赛默飞世尔科技公司；CKX41型奥林巴斯倒置显微镜，奥林巴斯（中国）有限公司；TGL-20M型高速台式冷冻离心机，湘仪离心机仪器有限公司；VORTEX-6型漩涡混合器、LX-300型迷你离心机，海门市其林贝尔仪器制造有限公司；YXQ-LS-50SI型立式压力蒸汽灭菌锅，上海博迅实业有限公司.

1.3 吲哚类衍生物抑制MGC-803细胞增殖的IC50值的测定

取对数生长期的MGC-803细胞，用0.25%，胰蛋白酶消化，以5×104，mL-1浓度接种于96孔培养板内，每孔100，μL，置37，℃、5%，CO2培养箱孵育24，h.吲哚衍生物组（2—20）加药终浓度分别为：10，μmol/L、1，μmol/L、0.1，μmol/L、10，nmol/L、1，nmol/L.同时设置等体积DMSO 溶剂对照组和阳性对照组（喜树碱），每组设3个平行孔.24，h后，每孔加入药物0.5，μL，溶剂对照组加入等体积DMSO.37，℃、5%，CO2培养箱孵育48，h后，每孔加入MTT 20，μL，37，℃、5%，CO2培养箱继续孵育4，h后终止培养，小心吸弃孔内培养基上清液，每孔加入DMSO 100，μL，置于培养箱10，min，使甲臜结晶充分溶解，酶标仪492、630，nm波长下测定吸光度，用Graph Pad Prism 5.0软件计算药物对细胞生长的半数抑制浓度IC50值［7］.

1.4 化合物16对MGC-803细胞形态学的影响

取对数生长期的MGC-803细胞，用0.25%，胰蛋白酶消化，以5×104，mL-1浓度接种于6孔培养板内，37，℃、5%，CO2培养箱培养24，h.每孔加入10，μL终浓度为 300，nmol/L化合物16，继续作用24，h.将各组细胞置于奥林巴斯倒置显微镜下观察细胞生长情况及形态变化.

1.5 化合物16对MGC-803细胞周期的影响

取对数生长期的MGC-803细胞，用0.25%，胰蛋白酶消化，以5×104，mL-1浓度接种于6孔培养板内，在37，℃、5%，CO2培养箱培养，24，h后每孔加入10，μL终浓度为 300，nmol/L化合物16，同时溶剂对照组加入等体积DMSO，继续培养6，h.以2，500，r/min离心5，min后收集细胞，并用预冷的PBS缓冲液500，μL清洗2次，2，500，r/min再次离心5，min收集细胞，缓缓加入预冷75%，乙醇，4，℃下固定过夜.1，000，r/min离心5，min后收集细胞，并用1，mL PBS清洗2次，最后用含有100，μg/mL RNase A、50，μg/mL PI、0.2%， Triton X-100 的PBS缓冲液500，μL重悬细胞，4，℃避光孵育30，min，立即用流式细胞仪测定细胞周期，得到其细胞周期的分布时相.

1.6 化合物16对MGC-803细胞凋亡的影响

收集对数期细胞铺板，细胞浓度为5×104，mL-1，化合物16加药终浓度为300，nmol/L，溶剂对照组加入等体积DMSO，加药刺激24，h后，以2，500，r/min离心5，min后收集细胞.然后用预冷的500，μL PBS清洗2次，以2，500，r/min离心5，min后收集细胞.用100，μL 1×Binding buffer 重悬细胞，使细胞浓度为1×106，mL-1，置于新的EP管，加5，μL FITC Annexin V 和 5，μL PI，25，℃避光放置15，min，每管加400，μL 1×Binding buffer用流式细胞仪进行细胞凋亡测定［8］.

2 结果与分析

2.1 吲哚类衍生物抑制MGC-803细胞增殖的IC50值的测定结果

通过MTT法检测5-取代吲哚类衍生物2—9对人胃癌细胞MGC-803体外抗肿瘤活性，其中化合物1（喜树碱）为阳性对照，化合物2（靛红）为母核化合物，结果见表1.

从表1中的数据可以看出，在C-5位引入甲基丙烯酸酯的化合物9表现出的抗肿瘤活性比母核化合物2至少提高130～230倍.因此，将化合物9作为先导化合物，进一步研究了N-衍生物的构效关系，结果见表2.

表1 吲哚类衍生物2—9抑制MGC-803细胞增殖的IC50值Tab. 1 IC50of indole derivatives 2-9 for MGC-803 cell

表2 吲哚类衍生物10—20抑制MGC-803细胞增殖的IC50值Tab. 2 IC50of indole derivatives 10-20 for MGC-803 cell

由表2可知，在N-1的位置引入苄基并在苯环的对位引入溴时，化合物16抑制MGC-803细胞生长的IC50值为最低，达到了0.08，μmol/L.与溴苄基的对位取代化合物16相比，间位和邻位溴苄基取代的化合物17和化合物18的生物活性有所降低，其IC50值分别为0.35，μmol/L和0.51，μmol/L.这一结果说明：R2处溴苄基取代的空间位置对化合物的活性有较大影响，对位的溴苄基取代能提高至少4～6倍的抗肿瘤活性.

表1和表2的构效关系分析结果表明：在19个新型吲哚类衍生物中，化合物16较其他衍生物具有更高效的抗肿瘤活性.因此，将选择化合物16为候选化合物，进一步研究该化合物对MGC-803细胞形态学产生的影响和对细胞周期及细胞凋亡的诱导作用.

2.2 化合物16对MGC-803细胞形态学的影响

在普通光学显微镜下观察MGC-803细胞生长状况时发现（图1）：溶剂对照组细胞生长旺盛，细胞形态完整；而化合物16（300，nmol/L）刺激24，h后，细胞形态出现变化，细胞从不规则形态变成圆形并呈漂浮状态，且多数呈漂浮状态.

图1 化合物16对MGC-803细胞形态学的影响Fig. 1 Effect of compound 16 on MGC-803 cell morphology

2.3 化合物16对MGC-803细胞周期的影响

化合物16对MGC-803细胞周期的影响如图2所示.从图2中可以看出：浓度为300，nmol/L的化合物16处理细胞6，h后，与溶剂对照组相比，化合物16组的G1期以及S期细胞明显下降，G2/M期细胞明显上升（从12.7%，增加至32.8%）.说明化合物16能够显著引起MGC-803细胞周期发生G2/M期阻滞.

图2 化合物16对MGC-803细胞周期的影响Fig. 2 Effect of compound 16 on MGC-803 cell cycle

2.4 化合物16对MGC-803细胞凋亡的影响

化合物16对MGC-803细胞凋亡的影响如图3所示.

图3 化合物16对MGC-803细胞凋亡的影响Fig. 3 Effect of compound 16 on MGC-803 cell apoptosis

从图3中可以看出：化合物16 以300，nmol/L处理MGC-803细胞24，h后，右下象限早期凋亡细胞显著增加（31.3%），比溶剂对照组的早期凋亡率（3.7%）增加了27.6%，说明候选化合物16能够诱导MGC-803细胞的凋亡.这可能是该化合物抑制MGC-803细胞增殖的另一个作用机制.

3 讨 论

吲哚类生物碱具有重要的生物活性，在已发现的天然吲哚类化合物中，有40多种可作为治疗型药［9］，如可治疗心血管病、糖尿病及肺癌等多种疾病.吲哚类化合物在医药领域的应用非常广泛，如主要由5-甲氧基吲哚制取的松果腺素（又名脑白金）直接作用于下丘脑，具有促进睡眠、调节内分泌及增强免疫力等多种生理功能［10］.

本文从吲哚衍生物的构效关系分析入手，由于一些N-苄基靛红衍生物表现出广泛的生物活性，我们以化合物9作为一个潜在的先导化合物，进一步集中N-衍生化类似物的构效关系.首先通过在C-5位改变取代基，通过分析化合物2—9对MGC-803胃癌细胞增殖抑制作用，发现C-5丙烯酸酯基团取代的靛红衍生物有潜在抗肿瘤活性，而后对C-5丙烯酸酯基团取代的靛红衍生物进行了一系列N取代，取代合成了10—20的化合物.以同样的方法对10—20这一系列化合物进行MTT法分析，从数据和不同取代基团分析选用活性较好的化合物16进行进一步的作用机制研究.

化合物16对MGC-803细胞的形态学影响和对细胞周期及凋亡的影响实验结果显示：MGC-803细胞经化合物16刺激后变成圆形，呈漂浮状态；化合物16能够显著引起MGC-803细胞周期发生G2/M期阻滞.肿瘤细胞过度增殖的本质是细胞周期调控异常，主要是两方面原因：其一为细胞周期的驱动机制失控（如Cyclins过表达，Cdk表达异常，CKI表达不足和突变Cyclins、Cdk和CKI表达异常）；其二为监控机制受损，其主要原因为G1/S、G2/M检查点异常［11］.化合物16对这些细胞周期调控蛋白的影响正在进一步的研究中.同时，在研究化合物16对MGC-803细胞凋亡的影响时发现，化合物16能够诱导MGC-803细胞凋亡.细胞凋亡是机体生长、分化、发育和病理过程中由基因编码调控的细胞主动自杀过程，机体通过凋亡使衰老、畸变和能导致疾病的细胞清除［12］.化合物16具体是通过哪个通路诱导MGC-803细胞凋亡的，有待进一步的研究.

综上，化合物16对胃癌细胞MGC-803增殖有较好的抑制作用，该化合物能诱导G2/M期的阻滞和细胞凋亡.这一结果对深入研究具有自主知识产权的新型吲哚类抗肿瘤药物具有重要意义.目前，关于化合物16更加深入的作用机制研究正在进行中.

［1］ 张屹，孟霞，秦大伟，等. 吲哚类抗肿瘤药物的研究进展［J］. 化工中间体，2011，1（1）：15-18.

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［3］ Zhou Yao，Zhao Hongye，Han Kailin，et al. 5-（2-carboxyethenyl）isatin derivative induces G2/M cell cycle arrest and apoptosis in human leukemia K562 cells ［J］. Biochemical & Biophysical Research Communications，2014，450（4）：1650-1655.

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［5］ 陈凛，李涛. 胃癌综合治疗现状与进展［J］. 世界华人消化杂志，2008，16（6）：571-574.

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［12］Kaczanowski S，Sajid M，Reece S E. Evolution of apoptosis-like programmed cell death in unicellular protozoan parasites ［J］. Parasites & Vectors，2011，4（4）：250-254.

责任编辑：郎婧

Effects of Novel Indole Derivatives on Human Gastric Cancer MGC-803 Cell Proliferation

TENG Yuou，ZHAO Hongye，ZHOU Yao，HAN Kailin，LU Bin，SUN Hua
（College of Biotechnology，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457，China）

In order to study the effect of indole derivatives on human gastric cancer cell proliferation and its mechanism，the structure-activity relationships of 19 indole derivatives were analyzed，and compound 16 with a novel structure was finally screed，which had significant anti-tumor activities.In further research，it was found that compound 16 can induced G2/M phase arrest in MGC-803 cells.After treatment，compound 16 also caused apoptosis in MGC-803 cells.

indole derivatives；cell proliferation；apoptosis

R962

A

1672-6510（2016）03-0016-04

10.13364/j.issn.1672-6510.20150114

2015-09-05；

2015-09-29

国家自然科学基金资助项目（31301142）；大学生创新创业训练计划资助项目（201410057069）

滕玉鸥（1976—），女，吉林人，副教授；通信作者：孙 华，副教授，sunhua@tust.edu.cn.

数字出版日期：2015-12-10；数字出版网址：http://www.cnki.net/kcms/detail/12.1355.N.20151210.1045.006.html.