miRNA-29 调节Wistar大鼠脑缺血再灌注损伤的研究①

李　睿，陈克研，金玉玲

(1.佳木斯大学研究生学院，黑龙江 佳木斯 154007；2.佳木斯市肿瘤医院，黑龙江 佳木斯 154007； 3.佳木斯大学附属第一医院,黑龙江 佳木斯 154003)



miRNA-29 调节Wistar大鼠脑缺血再灌注损伤的研究①

李睿1,2，陈克研3，金玉玲3

(1.佳木斯大学研究生学院，黑龙江 佳木斯 154007；2.佳木斯市肿瘤医院，黑龙江 佳木斯 154007； 3.佳木斯大学附属第一医院,黑龙江 佳木斯 154003)

摘要：目的：探讨微小RNA29(miR-29)在大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤模型中的保护作用及机制。方法：建立大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤模型，选择健康成年雄性Wistar大鼠65只，随机分为假手术对照组和缺血1.5h再灌注2h，3h，6h，12h，1d，2d，3d，7d 组，每组6只，建立线栓法大鼠脑缺血再灌注模型(MACO)，采用定时定量 PCR 法(real time PCR)比较各组病灶组织的 miR-29表达；反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)观察凋亡相关基因Bcl-2表达的动态变化。结果：MACO组脑缺血病灶组织的miR- 29表达较假手术组降低，而Bcl-2 mRNA表达水平明显上调(P<0.05)。脑缺血再灌注2h后，大鼠脑缺血周围区出现凋亡细胞，同时Bcl-2 mRNA 开始表达，随着缺血再灌注时间的延长呈增高趋势，1d达高峰，7 d接近假手术组水平。Wistar大鼠脑部MACO后 miR-29 显著下降，同时Bcl-2的表达上调(P<0.05)，经回归计算，相关系数R2=-0.9928。结论：miR- 29对Bcl-2负调控可能是抑制脑缺血再灌注损伤的一种机制。

关键词：脑缺血；再灌注；miR-29；Bcl-2；Wistar大鼠

线栓法切断脑中动脉(middle cerebral artery occlusion，MCAO) 建立局灶性大鼠脑缺血再灌注模型，经长期验证可以模拟人类脑梗死溶栓及其他血管再通的生理病理过程，是研究脑缺血性再灌注损伤的适用模型[1]。实验证明，经历脑缺血再灌注后，神经元死亡包括凋亡和坏死，其中凋亡是主动可逆过程，而能够调控细胞凋亡的最重要基因之一是Bcl-2[2]，很多学者也通过调节一些重要基因表达，进而减少由脑缺血缺氧引起的细胞凋亡起到保护脑细胞的作用，其中Bcl-2基因调控最为常见[3～5]。此外，微小 RNA 如 miR- 29低表达对心脏缺血再灌注和肝脏缺血再灌注损伤均有保护作用[6]，关于 miR- 29 在脑缺血性再灌注损伤中的作用尚未研究。本实验重点研究脑缺血再灌注损伤中 miR-29及可能靶基因Bcl-2的表达情况，探讨脑缺血性再灌注损伤中，miR-29的可能调控机理。

1实验材料和动物

1.1实验动物

240～280g的健康成年雄性Wistar 大鼠65只，由佳木斯大学动物实验中心提供。

表1　引物序列

1.2实验材料

RNA 反转录试剂盒 PrimeScript RT reagent Kit (TaKaRa，日本)；荧光定量试剂 SYBR Green PCR Mas-terix(Bio-Rad，美国)；组织总RNA 提取试剂 Trizol(Invitrogen，美国)。

2方法和结果

2.1MCAO大鼠模型的制备及分组

Wistar大鼠于环境温度18～22℃，光暗周期12h饲养。参考Zea-Longa[7]的5分制评分标准对大鼠进行评分并参照评分进行随机分为9组，假手术组和缺血1.5h再灌注2h，3h，6h，12h，1d，2d，3d，7d 组，去除个别死亡的大鼠、蛛网膜下腔出血者，确保每组6只。应用Zea-Longa 的线栓法阻断颈外动脉建造脑缺血性再灌注损伤模型。假手术组只需用尼龙线插入10 mm，后手术操作同其他模型组。

2.2实验动物的取材

依据Collaco-Moraes等[8]的大鼠局灶性脑缺血解剖定位方法，将纹状体和额叶皮层内侧等区域界定为缺血周围区，纹状体外侧区和将顶叶皮层界定为缺血中心区。取材后，于-80℃冷冻保存，备用。

2.3RT- PCR 法检测脑组织中 miR- 29 及Bcl-2的表达

参照试剂盒操作说明从上述的冷冻脑组织中提取总RNA， 然后将RNA逆转录合成 cDNA第一条链。以cDNA 为模板进行PCR反应， 放入定量 PCR 仪按中按照两步法进行PCR 扩增。条件为94℃2min，94℃20s，50～60℃(依据引物Tm值可变)20s，60℃40s，45cycles。RT-PCR引物序列见表2。

表2　RT-RCR引物序列

2.4体外抑制大鼠脑细胞 miR-29后Bcl-2蛋白表达的检测

体外培养大鼠脑细胞并汇集，采用转染试剂将终浓度分别为100、50和0nmol/L miR-29抑制剂，依次瞬时转染至各组大鼠脑细胞上。经4～6 h更换培养液，于48h收集脑细胞，提取总RNA 及总蛋白，Western blot 检测蛋白表达情况，RT- PCR 检测miR-29表达。

2.5统计学方法

3结果

3.1脑缺血再灌注损伤大鼠的脑组织中 miR-29表达

提取各组大鼠脑组织的总RNA，RT- PCR 测miR-29的变化。结果表明，miR-29的表达从再灌注损伤后2h开始下调，12h最低且一直维持至2d，脑组织中的miR-29 表达在缺血再灌注损伤12h时，较比对照组显著下降，具有统计学意义(P<0. 01)，见图1。

图1　脑缺血再灌注损伤大鼠的脑组织中 miR-29表达(**P<0.01)

3.2脑缺血再灌注损伤大鼠的脑组织中Bcl-2 mRNA RT- PCR表达

各缺血再灌注组，缺血周围区于再灌注后2h后，Bcl-2 mRNA呈弱表达；与再灌注6h时，Bcl-2 mRNA 表达开始增强；在再灌注12h时，Bcl-2 mRNA 表达开始最强，阳性神经细胞数量最多；再灌注2d时，Bcl-2 mRNA表达逐渐减弱；第7天，Bcl-2 mRNA 表达与对照组无显著性差异。缺血中心区于再灌注2～3h时， Bcl-2 mRNA表达开始减弱，然后迅速提升直至12h可达高峰，随后开始减弱，在第7天后，Bcl-2 mRNA表达与假手术组无显著性差异。见表3。

3.3大鼠脑细胞 miR-29经体外抑制 后的 Bcl-2蛋白表达

由实验结果可知，通过在体外抑制miR-29表达，实验各组的大鼠脑细胞中Bcl-2蛋白表达随mmu-miR-29 inhibitor的浓度增加，其表达降低，与对照组比较，当抑制剂浓度为100nmol/L和50nmol/L时具有显著性差异(P<0. 05)，以抑制剂浓度和miRNA29表达倍数进行回归计算，所得回归方程y =-0.0156x+1.84，相关系数R2=-0.9437，由此说明，Bcl-2的蛋白表达与mmu-miR-29抑制剂浓度呈负相关，见图2。

图2　体外抑制大鼠脑细胞miR-29后Bcl-2蛋白表达(**P<0.01)

分 组缺血周围区缺血中心区空白组1.08±0.651.02±0.12缺血再灌注2h26.45±2.11*4.11±0.67**缺血再灌注3h27.22±1.05*4.45±0.89**缺血再灌注6h59.04±2.01**11.72±2.13**缺血再灌注12h113.69±9.24**14.91±10.05*缺血再灌注1d108.21±1.95**13.58±2.10*缺血再灌注2d55.12±1.12*7.09±1.45*缺血再灌注3d21.44±1.21*3.09±1.07缺血再灌注7d1.79±0.251.36±0.72

注：与对照组对比，*P<0.05，**P<0.01。

4讨论

缺血再灌注损伤是以脑缺血中心区的神经元坏死为主要特点，骤然缺血便会导致脑能量代谢和供氧，进而部分神经元的部分基因调控未来得及表达便被动死亡。大量凋亡细胞大量出现并有可能凋亡。因此，促进受损神经细胞恢复并抑制细胞死亡，是治疗缺血性脑血管损伤疾病的主要途径之一。桑川等人通过实验发现Bcl-2蛋白可能是细胞受到严重损伤前的基因产物，脑神经细胞在受到轻微损伤时，Bcl-2出现表达，不受刺激不表达或者已经表达的产物失活[9]。本实验在成功建立大鼠MACO模型后，发现在缺血早期的各不同时间点得Bcl-2的表达变化和细胞凋亡的情况，结果表明缺血周围区于再灌注后2h后，Bcl-2 mRNA开始表达，再灌注12h时阳表达最强，随之减少直至再灌注7d与假手术组接近；缺血中心区，再灌注2h Bcl-2 mRNA 弱表达，12h达到高峰，7d后Bcl-2 mRNA 接近假手术组无显著性差异。

微小RNA 是一类高度保守的非编码小RNA，对基因表达与调控具有重要作用[10]。本实验通过对假手术组与模型组的比较分析发现：缺血再灌注损伤模型组的较比假手术组，miR- 29表达明显降低，而Bcl-2 蛋白表达则明显上调，以缺血中心区Bcl-2 mRNA和miRNA29表达结果进行回归计算，所得回归方程y=-26.377x+32.851，相关系数R2=-0.9928，因此Bcl-2表达与 miR-29表达呈现一定的负相关，结合实验结果可判断，在缺血性再灌注损伤的组织中，miR-29通过负调控Bcl-2表达，间接对神经细胞有保护作用。而Bcl-2是否是miR-29的靶基因有待进一步验证。

参考文献：

[1]王新程, 王进全.大鼠全脑缺血再灌注时依托咪酯对Bcl-2 和相关因子的关系[J].黑龙江医药科学, 2010, 33(3): 28-29

[2]Ahmad A, Khan MM, Hoda MN, et al. Quercetin protects against oxidative stress associated damages in a rat model of transient focal cerebral ischemia and reperfusion [J].Neurochem Res, 2011, 36(8): 1360-1371

[3]李喜成, 王秀丽, 颜玉. 凋亡抑制蛋白 survivin在食管鳞癌中的表达及其与p53 Bcl-2相关性研究[J]. 黑龙江医药科学, 2006,29(3): 22-24

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[5]刘晓梅, 位学海, 刘月霞, 等. 银杏叶提取物对局灶性脑缺血/ 再灌注大鼠突触素表达的影响[J]. 黑龙江医药科学, 2007,30(2): 4-6

[6]滕建曦, 刘国庆, 孔亮亮,等.微小 RNA29 调节小鼠肝脏缺血再灌注损伤的研究[J]. 中华临床医师杂志(电子版), 2013, 7(9)：3930-3934

[7]Zea -Longa E, Weinstein PR , Carlson S, et al. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J].Stroke, 1989, 20(1):84

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[9]桑川, 黄昕艳, 李艳丽. 大鼠大脑中动脉缺血再灌注损伤细胞凋亡及Bcl-2分布情况的观察[J].黑龙江医药科学, 2003,26(2):1-3

[10]Francesco F, Clara N. MicroRNA:basic mechanisms and transcriptional regulatory networks for cell fate determination[J].Cardiovasc Res, 2008, 79:553-556

基金项目：①1.黑龙江省博士后科研基金项目，编号：LBH-Z14204；2.国家博士后科学基金，编号：2015M571454。

作者简介：李睿(1989～)女，黑龙江佳木斯人，在读硕士研究生。 通讯作者：金玉玲(1969～)女，黑龙江密山人， 硕士，主任医师，硕士研究生导师。E-mail:jyl2017@sina.com。

中图分类号：R743

文献标识码：A

文章编号：1008-0104(2016)03-0005-03

(收稿日期：2016-02-20)

The research on micro RNA29 in regulation of reperfusion for cerebral ischemia injury in Wistar rats

LIRui1,2，CHENKe-yan3,JINYu-ling3

(1. Graduate College of Jiamusi University, Jiamusi 154007, China;2. Jiamusi Tumour Hospital, Jiamusi 154003,China；3. The First Affiliated Hospital of Jiamusi University, Jiamusi 154003,China)

Abstract:Objective: To explore the protective mechanism of microRNA29(miR- 29) in regulation of reperfusion for cerebral ischemia injury in Wistar rat. Methods: 65 adult male Wistar rats were randomly divided into sham control group and cerebral ischemia-reperfusion 2h, 3h, 6h, 12h, 1d, 2d, 3d, 7d groups (n=6). Suture method was used to set up the middle cerebral artery occlusion (MCAO) and reperfusion model. The real time PCR was used to detect the expression of miR-29 and the reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) was applied to observe the expressions of Bcl-2 in rats brain tissue. Results: The level of Bcl-2 in MACO groups were significantly higher than that in sham control group while the expression of miR-29 in MACO groups were lower(P<0.05). Bcl-2 mRNA positive neurons were observed in the peripheral area in 2 hours after reperfusion. Then the value peaked on in the first day, and decreased to normal level after 7 days. The expression of miR-29 was significantly down- regulated after MCAO in rats(P<0.05),R2=- 0.9928 after regression calculating. The underline protective mechanism is possibly that Bcl-2 is the potential target of miR-29．Conclusion: The negative regulation of miR-29 on Bcl-2 is a mechanism that possibly restrain the brain ischemia-reperfusion.

Key words:cerebral ischemia; reperfusion; miR-29; Bcl-2; Wistar rat