机械力加载IGF-I转染PDL细胞对α辅肌动蛋白影响的研究①

杨东红，付　爽，冯卉姗，侯玉泽，赵　刚， 叶之慧，吴立鹏

(佳木斯大学口腔医学院，黑龙江 佳木斯 154002)



机械力加载IGF-I转染PDL细胞对α辅肌动蛋白影响的研究①

杨东红，付爽，冯卉姗，侯玉泽，赵刚， 叶之慧，吴立鹏

(佳木斯大学口腔医学院，黑龙江 佳木斯 154002)

摘要：目的：观察IGF-I转染对应力作用下牙周膜成纤维细胞α辅肌动蛋白mRNA表达水平的影响。方法：应用外源性IGF-I转染人牙周膜成纤维细胞，使用四点弯曲加力装置对转染组和为转染组细胞加力，RT-PCR检测不同加力时间点各组细胞的α辅肌动蛋白基因表达变化。结果：在机械力刺激下IGF-I转染组细胞和未转染组细胞的α辅肌动蛋白mRNA表达量随着加力时间延长明显上调，且转染组和未转染组差异有统计学意义。结论：IGF-I转染对机械力加载状态下人牙周膜成纤维细胞的α辅肌动蛋白有较强的调控作用。

关键词：牙周膜成纤维细胞；α辅肌动蛋白；转染；IGF-I

正畸牙齿移动是在力学信号的作用下，牙周组织发生生理限度内的组织改建，使牙齿向预定的方向移动[1.2]。在正畸过程中，力学信号传递到牙周膜成纤维细胞骨架，使其发生形态和结构上的改变，导致与细胞骨架相关联的化学信号传递通道产生变化，把力学信号转变成细胞能理解和执行的化学信号，进而使牙周膜细胞为了适应力学环境的变化基质代谢发生改变[3.4]。细胞骨架由微丝、微管和中间纤维构成，微丝的基本成分是肌动蛋白(actin)，它的变化可以反映出细胞骨架的形态和结构变化[5,6]。本实验通过转染外源IGF-I基因进入离题培养人牙周膜成纤维细胞，研究力学信号刺激引起离体培养细胞力学模型的肌动蛋白mRNA变化情况，进而探讨PDL细胞骨架的结构和形态改变，为深入研究正畸牙周组织改建机制打下坚实的基础。

1材料和方法

1.1主要试剂和仪器

Lipotap脂质体转染试剂(上海碧云天生物技术有限公司)，Total RNA Extractor (Trizol)试剂盒(上海生工生物工程股份有限公司)和M-MuLV 逆转录酶(上海生工生物工程股份有限公司)，超净工作台(Spegair，美国)，Forcel四点弯曲细胞力学加载仪(四川大学华西口腔医院正畸科和电子科技大学联合研 制)，CO2恒温培育箱(Sanyo，日本),分光光度计(UV-2401PC，上海)，倒置显微镜及照相机系统(Olympus,日本)。

1.2人牙周膜成纤维细胞的培养、鉴定和转染

经患者和(或)其家长同意，取11～16岁青少年因正畸治疗拔除的健康双尖牙，用组织块法进行原代培养，常规传代培养。取第2代细胞爬片，用免疫组化SP法进行波形丝蛋白和细胞角蛋白染色，证明其为中胚层来源的成纤维细胞，取第 4～6代的细胞作为研究对象。取6孔培养板，向每孔中加入2mL含2×105个PDL细胞培养液，37℃ CO2培养至60%汇合用2mL不含血清培养液漂洗两次，再加入1mL不含血清培养液培养，加入IGF-错误！未找到引用源。目的基因和脂质体混合物，摇匀，37℃温箱置24h，吸除无血清转染液，换入正常培养液孵育PDL细胞，完成转染。用G418培养液对转染IGF-I基因的细胞进行筛选，获得稳定表达IGF-I基因的人牙周膜成纤维细胞株。

1.3实验分组及HPDLF力学模型构建

经IGF-I转染的HPDLF为实验组，正常HPDLF设为对照组，各组细胞经胰蛋白酶消化制成细胞悬液，以1.0×109L-1密度接种于细胞培养板中1/3，37℃恒温培养。在细胞加力前，将原培养基换成分化培养基继续培养24h(37℃、饱和湿度、95%空气、5%CO2培养箱中同步化孵育)，将接种在加力板上的各组细胞置于Forecl四点弯曲力学加载仪施加动态张力(2000u strain，频率0.5Hz，位移1mm)，实验组和对照组均设立加力3h、6h、12h、24h组和未加力组，每个实验组包含3个实验样本，各组重复3次。

1.4RT-PCR检测牙周膜成纤维细胞α-肌动蛋白表达

在各组细胞的加力板上每10cm2面积加入1mL Trizol液裂解细胞，按照Total RNA Extractor试剂盒要求提取细胞总RNA，电泳检测 RNA 是否降解，紫外分光光度计测量 RNA 浓度和纯度。利用 M-MuLV逆转录酶，将提取的总RNA 逆转录为cDNA，以其为模板，加入α-actin上游引物：5＇-GGCCGAGATCTCACCGACTACC-3＇，下游引物：5＇-AGCCGCCGATCCAGACAGAATA-3＇(引物由上海生工公司设计合成)，在95℃ 10min，95℃ 15s，58℃ 60s， 40个循环的条件下进行PCR反应，以GAPDH为内参进行PCR，其上游引物：5＇-GGCAGCCCAGAACATCATCC-3＇，下游引物：5＇-GCCAGCCCCAGCATCAAAG-3＇(引物由上海生工公司设计合成)，反应结束后取产物进行琼脂糖凝胶电泳,凝胶图像分析系统软件扫描图像并测定各电泳条带相对积分光密度值。

1.5统计学方法

采用SPSS16.0软件单因素方差分析，依据α-actin和内参GAPDH的电泳图，采用凝胶图像分析系统软件扫描图像并测定各电泳条的灰度值，每一次条带测量3次，将目的基因与内参的灰度值相比计算相对积分光密度值，以P<0.05为检验水平。

2结果

2.1人牙周膜成纤维细胞生长观察及鉴定

人牙周膜组织原代细胞7d左右从组织块向四周放射状游出，显微镜下见细胞多呈长梭形、胞体丰满、胞浆均匀、胞核圆、核仁清晰。细胞传代后贴壁生长、性状稳定、状态良好，经免疫细胞化学检测细胞呈抗角蛋白阴性、抗波形丝蛋白阳性，具有中胚层来源的成纤维细胞特性。

2.2细胞的筛选

转染IGF-I基因后牙周膜成纤维细胞胞浆内有细小的深棕色颗粒沉积，继续培养72h，待细胞生长接近融合时传代，传代后的细胞培养至50%～70%融合时更换浓度为800μg/mL的G418培养液筛选(以未转染的 PDLC细胞做对照)。细胞培养4d后，对照组细胞完全死亡，而转染组仍有生长良好的，将G418浓度降低到200μg/mL继续筛选至2周，此时仍生长良好的细胞即认定为是稳定表达IGF-I基因的人牙周膜成纤维细胞株，可用以下一步实验。

2.3周期性应力对α辅激动蛋白mRNA表达的影响

见表1。

表1　α辅肌动蛋白 mRNA的OD比值

△表示不同实验组内各加力时间点与未加力组差异有统计学意义，*表示不同加力时间点两实验组差异有统计学意义。

如表1所示，在应力作用下α-肌动蛋白mRNA的OD值与对照组比较均有所增加，各加力时间点与对照组比较差异都有显著性差异，且随着加力时间的延长α-actin mRNA表达量呈上调趋势。在同一实验组内加力6h与3h比较、加力12h与6h比较差异有统计学意义，加力24h与12h比较差异无统计学意义。转染组和未转染组比较，各加力时间点α-actin mRNA表达均有显著性差异。

3讨论

牙周膜细胞(periodontal ligament cell， PDLC)是牙周组织最主要的细胞成分，具有教强的合成胶原的能力，在一定条件下可以合成矿物盐，为牙周膜韧带的再附着创造条件，是正畸矫治力的直接效应细胞，在牙周组织改建中起着关键的调控作用[7～9]。PDLC感受应力刺激信号转化为生物-化学信号，通过细胞骨架传导至细胞的各个部位，并作为效应性细胞产生一系列生物活化因子，如IP3、IGF-1、 BMP-2、 ALP等，使牙周膜胶原更新、成骨细胞和破骨细胞活化，其增殖活性和功能状态也直接反映了牙周组织状态[10～13]。胰岛素样生长因子是一类广泛存在于机体多种组织中的蛋白多肽，在促进机体的生长发育、营养代谢、细胞分化、牙槽骨的再生修复以及正畸牙周组织改建过程中方面有着重要的生物学作用，本实验通过转染将外源性IGF-I基因导入体外培养的PDL细胞，进行细胞力学实验，观察IGF-I对PDLC的影响，进而探讨其对正畸牙周组织改建的作用机制。

细胞骨架(cytoskeleton，CSK)普遍存在于真核细胞胞浆和细胞核中，是由纤维状结构组成的蛋白质网状支架，为细胞形态的基础。细胞骨架体系是一种动态结构，当外力超过细胞骨架抵抗变形能力时产生适应性形变，为调节细胞-力学信号转导的重要环节[14,15]。α辅肌动蛋白(α-actin)为细胞骨架与细胞运动研究中的热点蛋白，它是一种重要的肌动蛋白交联蛋白，可通过与肌动蛋白结合来维持细胞的形态、赋予细胞强度和韧性；借助与钙粘素、整合素等的协同作用，在调节细胞形状、稳定细胞黏附和细胞运动中发挥重要作用[16,17]。研究应力作用下α辅肌动蛋白表达水平的变化有利于进一步了解应力对细胞骨架变化的调节过程和机理。本实验研究表明在周期性应力作用下随着加力时间增加α-肌动蛋白mRNA含量逐渐增高，加力3h、6h、12h和24h时α-actin mRNA的OD值与未加力时比较差异有显著性，但加力24h与12h比较差异无统计学意义，也就是说加力12h是α-肌动蛋白对机械力刺激做出反应最活跃的时点。结果提示机械力刺激可以引起牙周膜成纤维细胞的α-肌动蛋白含量的变化，进而使细胞骨架形态发生改变以适应细胞运动和形变。胰岛素样生长因子是一类多功能的细胞调控因子，在牙周组织中通过自分泌或旁分泌等形式刺激Ⅰ型胶原纤维的生成，增强牙周膜细胞ALP活性，促进牙周膜细胞的迁移、附着、增殖和分化，在牙周组织改建过程中发挥重要的作用[18～20]。本实验成功的建立了转染IGF-Ⅰ基因的牙周膜成纤维细胞，观察在机械力加载的条件下其对α-肌动蛋白的影响，结果显示：转载IGF-I组的PDLCα-肌动蛋白mRNA含量变化趋势与未转染组相同，且相同加力时点其α-actin mRNA的OD值高于未转染组，两者差异有统计学意义。本实验证实机械力刺激会对细胞的形态和功能产生影响，牙周膜成纤维细胞对机械力刺激不仅是被动适应，还有主动的力学反应，IGF-I在PDLC对力信号刺激的主动反应中主要是通过调节α-actin含量实现的。

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基金项目：①黑龙江省教育厅科学技术研究项目，编号：12531706。

作者简介:杨东红(1982～)女，黑龙江佳木斯人，硕士，主治医师。 通讯作者:吴立鹏(1963～)男，黑龙江佳木斯人，学士，主任医师，教授，硕士研究生导师。E-mail: wlpkq@sina.com。

中图分类号：R783.5

文献标识码：B

文章编号：1008-0104(2016)03-0010-03

(收稿日期：2016-01-26)

The effects of mechanical force loaded IGF-I transfected eriodontal ligament cells on α-actin

YANGDong-hong,FUShuang,FENGHui-shan,HOUYu-ze,ZHAOGang,YEZhi-hui,WULi-peng

(College of Stomatology of Jiamusi University, Jiamusi 154002,China)

Abstract:Objective: To investigate the effects of mechanical force loaded IGF-I transfected periodontal ligament cells on α-actin mRNA expression levels. Methods: Exogenous IGF-I was used to transfect human periodontal ligament. Four-point bending strain system acted on transfected groups and untransfected groups. α-actin mRNA was detected by RT-PCR at different time points. Results: Under mechanical stimulation, α-actin mRNA of cells in transfected groups and untransfected groups were rounded up significantly with loading time prolonged. Conclusion: IGF-I transfection had strong regulatory role to mechanical force loaded periodontal ligament cells on α-actin.

Key words：periodontal ligament cells；α-actin；transfection；IGF-I