RECK在胆脂瘤型中耳炎中的表达①

于海莲，周一莎，程秀华，秦迎春

(1.佳木斯大学附属第一医院，黑龙江 佳木斯 154003;2.双鸭山市人民医院耳鼻喉科，黑龙江 双鸭山 155100)



RECK在胆脂瘤型中耳炎中的表达①

于海莲1，周一莎2，程秀华1，秦迎春1

(1.佳木斯大学附属第一医院，黑龙江 佳木斯 154003;2.双鸭山市人民医院耳鼻喉科，黑龙江 双鸭山 155100)

摘要：目的：研究基质金属蛋白酶抑制剂RECK (reversion-inducing -cysteine- rich protein with Kazal motifs，RECK)在胆脂瘤型中耳炎上皮和正常外耳道上皮中的表达特点及意义，并探讨 RECK对胆脂瘤型中耳炎侵袭能力的影响。方法:采用免疫组织化学染色法(SP法)检测31例胆脂瘤型中耳炎上皮和23例正常外耳道上皮中RECK的表达。结果:31例胆脂瘤上皮组织样本中，有14例(45.16%)标本检测到RECK的阳性表达；23例外耳道上皮组织样本中有21例(91.30%)检测到RECK的阳性表达，且两组比较有显著统计学差异(P<0.01)。结论:RECK在胆脂瘤型中耳炎上皮组织中低表达，在外耳道上皮组织中高表达，预示此因子参与中耳胆脂瘤的发病过程及在病情进展中起到负调节作用。

关键词：胆脂瘤；中耳炎；RECK; 免疫组织化学

胆脂瘤型中耳炎(cholesteatoma of middle ear)是耳鼻咽喉科常见的疾病，是一种位于中耳乳突腔内的囊性结构，而非真性肿瘤，临床发现，胆脂瘤型中耳炎具有类似于恶性肿瘤的生物学特征，如破坏性、侵袭性、迁移性、异常调控增殖性、复发性等，但本病在病理上属于良性病变，而非恶性肿瘤[1]。这些特性能使其导致不同程度的骨质破坏，从而引起不同程度的听力损失，甚至引发前庭功能障碍及面神经麻痹一系列病症，使患者的生命安全受到严重威胁。基质金属蛋白酶抑制剂 RECK(reversion inducing cysteine rich protein with Kazal motifs， RECK)是Takahashi发现的一种新型转移抑制基因，它的表达与肿瘤的侵润及转移、新生血管的形成都有着密切关系。近年来，围绕RECK与肿瘤侵袭转移这一主题，先后有肝癌、胰腺癌、乳腺癌和肺癌等相关文献报道。有文献报道[2]，RECK的表达量在肿瘤侵袭能力的强弱及患者预后等方面都呈负相关性。RECK对肿瘤生长、侵润、转移等过程，可能是通过负性调控MMP-2、9及控制模型基质金属蛋白酶-1的分泌来完成的。同时其抑制肿瘤血管生成的作用也可抑制肿瘤生长、侵袭和转移。RECK作为一种基质金属蛋白酶抑制基因，已被证实能通过下调MMPs的表达及影响肿瘤血管的新生，来抑制多种肿瘤的生物学特性，进而抑制肿瘤的转移和侵袭[3]。本文采用免疫组织化学方法来检测RECK在胆脂瘤型中耳炎上皮中的分布及表达水平，根据结果进一步探讨在胆脂瘤上皮增殖中的作用。

1资料与方法

1.1一般资料

①实验组：31例胆脂瘤型中耳炎上皮组织，标本均来自于佳木斯大学附属第一医院耳鼻喉科2013-04～2014-10住院手术的中耳胆脂瘤患者。其中男17例，女14例；年龄25～69岁，平均48.5岁。②对照组：23例正常外耳道上皮组织，标本均来自于佳木斯大学附属第一医院耳鼻喉科2013-04～2014-10住院行乳突根治术患者的正常外耳道上皮组织。男12例，女11例；年龄38～80岁，平均55.8岁。

1.2试剂

鼠抗人RECK多克隆抗体,SP试剂盒等均购自上海越研生物科技有限公司。

1.3方法

所有标本均经过甲醛固定，再用酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋。经过HE染色并明确病理诊断，切片厚度取4～5μm。RECK应用免疫组化SP法检测。将石蜡切片、脱蜡、水化，后用3%H2O2室温孵育10～20min，PBS 冲3min×3；经胰酶消化后37℃孵育箱25min，用PBS冲洗5min×3；再滴入血清室温孵育5min，用PBS 冲洗；加1抗MMP-14，经4℃过夜，PBS冲洗5min×3;滴入生物素标记的2抗，再经室温孵育、PBS冲洗；滴加过氧化物亲和素酶溶液， 孵育、冲洗；滴加DAB显色液，镜下观测并控制显色时间；经自来水清洗后用苏木复染、脱水、透明、封片。用已知阳性对照片作为阳性对照，用PBS 代替1抗作为阴性对照。

2结果判定

所有切片均采用双盲法进行观察和计数，避开组织切片的边缘，选择颜色明显强于背景着色处计数。每张病理切片至少在高倍显微镜(200×)下观察10个以上不重复的视野，继而判断细胞染色强度和细胞染色百分率为记分方式[4]，得到判断结果如下：

(1)细胞染色强度(分)：0分：未染色；1分：弱染色；2分：中等强度染色；3分：强度染色。(2)细胞染色百分率(分)：0分 ：0%阳性细胞；1分：≤25%阳性细胞；2分：25%～50%阳性细胞；3分：>50%阳性细胞。两项计分相加后分成4级，判断标准为：0分(-)；1～2分(+)；3～4分()；5～6分()。其中"-"示为阴性表达，"+"示为阳性表达。

3统计学方法

采用SPSS 18.0统计软件包进行处理，阳性率的比较采用χ2检验，两两比较采用Spearman相关性分析，两者均以P<0.05作为检验标准，差异有统计学意义。

4结果

4.1RECK在正常外耳道上皮组织及胆脂瘤上皮组织中的表达情况，见表1。

4.2RECK在正常组织中有广泛的表达，阳性信号表达于细胞质内出现淡黄色、黄色、棕黄色颗粒。在中耳胆脂瘤组织中的表达:31例中耳胆脂瘤上皮中阳性表达为14例，阳性表达率为45.16%(14/31),见图1；在外耳道上皮组织中表达较高，多位于细胞浆，呈棕黄色或棕褐色颗粒，23例中阳性表达为21例，阳性表达率为91.30%(21/23),见图2。RECK在胆脂瘤中的表达明显低于正常外耳道上皮中，差异有统计学意义(χ2=6.973，P<0.05)。

图1　RECK在胆脂瘤组织中阴性表达(SP×200)

图2　RECKA在外耳道上皮中阳性表达(SP×200)

RECK-+总例数阳性率(%)中耳胆脂瘤组1795031(14)45.16外耳道上皮组2251423(21)91.3

注：χ2=6.973 ，P<0.05。

5讨论

RECK基因是长约87kb，定位在染色体9p13-p12上的一种抑癌基因，它具有独特的抑制MMPs活性与表达的功能。由日本学者 Takahashi等在1998年的v-Ki-ras转染小鼠纤维原细胞株NIH3T3中发现的[5]。许多研究证实，RECK基因起着负向调控许多癌基因的作用。研究表明[6]，许多肿瘤的发生、发展与RECK基因定位的区域密切相关。新生血管给肿瘤的持续增长提供了氧分和能量，MMPs的高度表达能够促进血管形成，它是通过过度降解ECM来实现的。RECK高表达时，能够抑制MMPs的表达，进而抑制血管的形成，RECK对于MMPs的这种调节关系，在肿瘤血管形成中十分重要。许多研究已经证实[7]RECK在肿瘤中的表达强度与其内部血管的多少呈现负相关性，RECK作为一种基质金属蛋白酶抑制基因，已被证实能通过下调MMPs的表达及影响肿瘤血管的新生，来抑制多种肿瘤的生物学特性，进而抑制肿瘤的转移和侵袭。目前的研究己经回答了许多问题，但是有很多的问题还有待解决。本实验采用免疫组化 SP法，检测 RECK在胆脂瘤型中耳炎上皮组织中及正常外耳道上皮组织中的表达，结果发现，RECK在正常组织中有广泛的表达，阳性信号表达于细胞质内出现淡黄色、黄色、 棕黄色颗粒状。在胆脂瘤型中耳炎上皮组织中的表达，31例胆脂瘤上皮组织中阳性表达为14例，阳性表达率为45.16%；在外耳道上皮组织中表达较高，多位于细胞浆，呈棕黄色或棕褐色颗粒，23例中阳性表达为21例，阳性表达率为91.30%；RECK在胆脂瘤中的表达明显低于正常外耳道上皮中，差异有统计学意义(χ2=6.973，P<0.05)。以上结果可能预示了RECK的表达缺失或降低在胆脂瘤型中耳炎的生成与发展的过程中起着重要作用。可能对胆脂瘤型中耳炎的生成与发展有着抑制的作用，其低表达可能引起胆脂瘤发病几率增高。

RECK在胆脂瘤型中耳炎上皮组织中低表达，在外耳道上皮组织中高表达，可能说明此因子参与胆脂瘤型中耳炎的发病过程及在病情进展中起到负调节作用。

参考文献:

[1]Arroyo A G,Genis L,Gonzalo P,et al.Matrix metallo proteinases:new routes to the use of MTI-MMP as a therapeutic target in angiogenesis-relateddisease[J].Curr-Pharm Des,2007,13(17):1787-1802

[2]张爱华，周一莎.基质金属蛋白酶-14在胆脂瘤型中耳炎中的表达及意义[J].黑龙江医药科学, 2015，38(3):35-36

[3]阎红娥,梁姗姗,鲍文华，等.RECK及MMP-9在非小细胞肺癌中的表达及意义[J]. 黑龙江医药科学, 2013，36(2)：11-13

[4]Tsunezuka Y,Kinoh H,Takino T,et a1.Expression of membrahe-type matrix Metalopmteinase1 (MT1-MMP) in tumor cells enhances pulmonary metastasis in an experimental metastasis assay[J].Cancer Res,1996,56(24)：5678-5683

[5]周旭峰，姚雅芬． MMP-2和CD147在中耳胆脂瘤中的表达[J]．黑龙江医药科学，2008，31(3):27-28

[6]李江华，张爱华，周旭峰． 中耳胆脂瘤上皮组织中 OPN 和 MMP9的表达及相关性研究[J]． 黑龙江医药科学，2013，36( 2):78-79

[7]周旭峰,张爱华,范宗宪，等.XIAP和XAF1在中耳胆脂瘤中的表达及其与细胞凋亡的关系[J]． 黑龙江医药科学，2013，36(2):65-66

基金项目:黑龙江省自然科学基金，编号:QC2010076。

作者简介：于海莲(1966～)女，黑龙江佳木斯人，本科，副主任护师。 通讯作者:秦迎春 (1968～) 女，黑龙江佳木斯人，本科，副主任护师。E-mail:milk821053941@163.com。

中图分类号：R764.21

文献标识码：A

文章编号：1008-0104(2016)03-0013-02

(收稿日期：2015-12-02)