U PLC-D A D检测减肥类中药制剂及保健食品中的4种非法添加成分

涂凤莲汪元符

（1南昌市新建区中医医院，江西 南昌 330100；2南昌市食品药品检验所，330038）

U PLC-D A D检测减肥类中药制剂及保健食品中的4种非法添加成分

涂凤莲1汪元符2

（1南昌市新建区中医医院，江西 南昌 330100；2南昌市食品药品检验所，330038）

目的：针对减肥类中药制剂及保健食品，建立了可能非法添加的酚酞、西布曲明、N-单去甲基西布曲明、N，N-双去甲基西布曲明等4种成分的超高效液相色谱-二极管阵列联用的检测方法。方法：采用Phenomenex Luna C18（2）100A色谱柱（150 mm×2.00 mm，3 μm），流动相为磷酸盐缓冲液（50 mmol/L磷酸氢二钾以磷酸调节pH值为6.0）及甲醇，梯度洗脱，柱温为35℃，流速为0.2 mL/min，进样量为5.0 μL，检测器为DAD检测器。结果：各成分检出限浓度为30 ng/mL，定量限浓度为50 ng/mL，线性范围为50～1 000 ng/mL，在线性范围内相关系数均在0.99以上，平均加样回收率在96.0%～ 101.2%。结论：建立的方法简便、快速、准确、灵敏度高、专属性好，用于减肥类中药制剂及保健食品中非法添加的快速检测优于现行法规标准所列的高效液相色谱法。

超高效液相色谱-二极管阵列；减肥类中药制剂及保健食品；酚酞；西布曲明；N-单去甲基西布曲明；N，N-双去甲基西布曲明；非法添加

在食品药品监督管理部门日常的监督抽检、风险监测及投诉举报受理的工作中，减肥类中药制剂及保健食品非法添加违禁药物成分的情况时有发生，严重危害着人民群众的身体健康及生命安全。现行法规标准［1］在检测此类非法添加时，采用先行薄层色谱初筛，再行高效液相色谱法定性及定量，最后液相色谱-质谱联用确证的方法。在实际的检测工作中，发现其中的高效液相色谱法存在着一定的缺陷，可能造成检测灵敏度降低或假阴性、漏检的结果。基于科学、公正、准确、高效的宗旨，为提高检测方法的灵敏度、准确度、精确度，本实验室建立了以下有效的超高效液相色谱-二极管阵列检测的方法，能够满足平时的监督检验需要。

1仪器、试剂与材料

Agilent 1290高效液相色谱仪（使用 DAD检测器），METTLER TOLEDO ME204E电子分析天平，METTLER TOLEDO XS105电子分析天平，昆山KQ-300DB型数控超声波清洗器，TG16-WS台式高速离心机（湘仪离心机），Millipore超纯水系统。

甲醇（色谱纯，Merck），乙腈（色谱纯，Merck），冰乙酸（色谱纯，麦克林A801303-500 mL），乙酸铵（优级纯，麦克林 A800998-500 g），磷酸（分析纯，麦克林 P816337-500 mL），磷酸氢二钾（分析纯，麦克林P816382-500 g）。

对照品：酚酞（100091-199601），盐酸西布曲明（100624-200401）、盐酸N-单去甲基西布曲明（520002-201301）、盐酸N，N-双去甲基西布曲明（520001-201301），均购自中国食品药品检定研究院。

样品：购自流通或医疗机构。中药制剂8批：体美减肥胶囊（规格：0.3 g，批号：130607），福瑞堂轻身减肥胶囊（规格：0.35 g，批号：131005），靓尔娜轻身减肥片（规格：108片，批号：130722），永孜堂降脂减肥片（规格：36片，批号：130301），堂旨舒降脂减肥片（规格：72片，批号：130722），形美轻身减肥片（规格：48片，批号：131015），同仁堂轻身消胖丸（规格：240粒，每100粒约重15 g，批号：130705），中一牌防风通圣丸（规格：6 g，批号：130701）。保健食品12批：轻身乐减肥胶囊（规格：0.20 g，批号：14070301）蜀宝减肥胶囊（规格：200 mg，批号：20150310），纽斯葆婷采减肥靓颜胶囊（规格：0.3 g，批号：FC158），美澳健秀中秀减肥胶囊（规格：0.4 g，批号：15202002），金奥力绿茶肉碱胶囊（规格：0.42 g，批号：14041901），康乃馨壳聚糖左旋肉碱荷叶片（0.7 g，批号：150401），奥斯莱康惠普生纤纤片（规格：600 mg，批号：20150301），汤臣倍健左旋肉碱茶多酚荷叶片（规格：1 220 mg，批号：20140514A），纽斯葆绿荷片（规格：0.4 g，批号：EC678），碧生源减肥茶（规格：2.5 g，批号：04150106），瑞德梦减肥茶（规格：2.5 g，批号：140106），半生缘天信减肥茶（规格：3 g，批号：141018）。

2方法与结果

2.1超高效液相色谱分析条件

分析柱：Phenomenex Luna C18（2）100A（150 mm× 2.00 mm，3 μm）；柱温：35℃；流速：0.2 mL/min；进样量：5.0 μL；检测波长：223 nm。流动相：A为50 mmol/L磷酸氢二钾以磷酸调节 pH值为6.0，B为甲醇。按表1进行梯度洗脱。

表1　　梯度洗脱程序

2.2对照品溶液的配制

取酚酞、盐酸西布曲明、盐酸N-单去甲基西布曲明、盐酸N，N-双去甲基西布曲明对照品各约10 mg，精密称定，以甲醇制成每1 mL中各含酚酞、西布曲明、N-单去甲基西布曲明、N，N-双去甲基西布曲明1 mg的溶液作为对照品储备液。精密量取对照品储备溶液1 mL，以甲醇制成各含100 μg/mL的溶液，作为对照品使用液。再以甲醇制成各含50，100，200，300，400，500，1 000 ng/mL的标准系列溶液。

2.3供试品溶液的配制

将8批分别为丸剂、片剂、胶囊剂（取内容物）的中药制剂样品及12批分别为胶囊（取内容物）、片、茶的保健食品样品研细，各取约0.50 g，精密称定，置 100 mL量瓶中，加入甲醇约80 mL，超声处理（功率 250 W，频率 35 kHz）15 min，放冷至室温，再加甲醇至刻度定容，摇匀，静置，取上清液经0.2 μm微孔滤膜过滤后，取续滤液，作为待测液。

2.4各成分检测波长的确定及专属性试验

按“2.2”的方法配制对照品溶液，取各含500 ng/mL的对照品溶液试验。按“2.3”的方法制备供试品（体美减肥胶囊）溶液、空白供试品（靓尔娜轻身减肥片）及空白供试品加标溶液。空白供试品为经法定方法［1］中所列的“液相色谱-质谱联用法”确证为阴性的空白供试品。分别取各成分对照品溶液单标、混合对照品溶液、试剂空白溶液、空白供试品溶液、空白供试品加标溶液，按“2.1”项下的条件检测。结果见图1～ 8。

由各成分的紫外吸收光谱图可知，酚酞的最大吸收波长为229 nm，西布曲明的最大吸收波长为223 nm，N-单去甲基西布曲明的最大吸收波长为223 nm，N，N-双去甲基西布曲明的最大吸收波长为223 nm。理论上选择各自的最大吸收波长为检测波长，可得到最高的检测灵敏度。比较图2～ 5的结果可知，当检测波长由223 nm变为229 nm时，西布曲明、N-单去甲基西布曲明、N，N-双去甲基西布曲明峰的吸收值明显降低，而酚酞峰的吸收值大致相当，因此当只用一个波长来检测，为获得较好的灵敏度，应选择各成分吸收值均好的223 nm。

由各成分混合对照品溶液、试剂空白溶液、空白供试品溶液、空白供试品加标溶液所采集的色谱图比较可知，试剂空白及供试品对各成分的检测无干扰，各成分峰均能基线分离，分离度R均在2.0以上，实测理论塔板数均在4 000以上。

由于中药制剂及保健食品成分复杂，经液相色谱检测各成分主峰保留时间与对照品一致且提取的紫外吸收光谱一致，需经液相色谱-质谱联用法确证。

图1　　混合对照223 nm波长采集色谱图

图2　　在8.838 min提取的酚酞对照紫外吸收光谱图

图3　　在18.004 min提取的西布曲明对照紫外吸收光谱图

图4　　在19.773 min提取的N-单去甲基西布曲明对照紫外吸收光谱图

图5　　在21.591 min提取的N，N-双去甲基西布曲明对照紫外吸收光谱图

图6　　试剂空白223 nm波长采集色谱图

图7　　空白供试品223 nm波长采集色谱图

图8　　空白供试品加标223 nm波长采集色谱图

2.5线性关系及检出限、定量限考察

采用“2.1”项下的色谱条件，以“2.2”项下的标准系列溶液进样检测。以检测所得峰面积为纵坐标，以标准系列溶液浓度（ng/mL）为横坐标，进行线性拟合。以采集的色谱图中检出峰的信噪比大于3时的浓度（ng/mL）为检出限，信噪比大于10时的浓度（ng/mL）为定量限。以在一定浓度范围内，相关系数大于0.99，为线性范围。结果如表2。

表2　4种成分标准曲线测定、检出限和定量限检测结果

4种成分在各自的线性范围内具有良好的线性关系，检出限均为 30 ng/mL，定量限均为50 ng/mL，灵敏度较高。

2.6精密度试验

选用标准系列溶液中各成分浓度为500 ng/mL的标准溶液，连续进样6针，计算各成分峰面积的相对偏差。结果如表3。

表3　4种成分精密度检测结果

结果各成分RSD值均在0.16%～ 0.34%之间，精密度良好。

2.7稳定性试验

选用标准系列溶液中各成分浓度为500 ng/mL的标准溶液，在 0，1，2，4，8，12，24 h分别进样，以各成分峰面积计算。结果如表4。

表4　4种成分稳定性检测结果

结果各成分RSD值均在0.45%～ 0.76%之间，表明24 h内能稳定检测。

2.8回收率试验

取中药制剂阴性样品：丸剂（同仁堂轻身消胖丸）、片剂（靓尔娜轻身减肥片）、胶囊剂（体美减肥胶囊）各1批，取保健食品阴性样品：茶（碧生源减肥茶）、片（康乃馨壳聚糖左旋肉碱荷叶片）、胶囊（轻身乐减肥胶囊）各1批，按“2.3”项下平行称样各3份，分别加入0.05，0.5，5.0 mL每1mL中各含100 μg的对照品使用液，置 100 mL量瓶中，加入甲醇约80 mL，超声处理（功率250 W，频率35 kHz）15 min，放冷至室温，再加甲醇至刻度定容，摇匀，静置，取上清液经 0.2 μm微孔滤膜过滤后，取续滤液测定。3份平行样最终加标浓度分别为50，500，1 000 ng/mL。以5次平行测定结果的均值与加标浓度相比较，回收率如表5～ 6。

表5　　中药制剂中加样回收试验结果

结果不同类型的中药制剂及保健食品各成分高、中、低三个浓度的回收率均在95.0%～ 99.8%之间。

2.9样品测定结果

检测了8批次中药制剂及12批次保健食品，结果均为阴性，并经“液相色谱-质谱联用法”确证为阴性。

表6　　保健食品中加样回收试验结果

3讨论

3.1西布曲明及其衍生物非法添加的情况分析

西布曲明的非法添加时有发生。从最初的直接添加西布曲明发展为西布曲明、N-单去甲基西布曲明、N，N-双去甲基西布曲明同时添加，这样能达到有效剂量不变的同时，减低了每一种成分的添加量，增加了检出难度。且保健食品中非法添加居多。相对药品，保健食品有服用量较大特点。

以西布曲明日用量5 mg分析。假设添加入某膳食纤维素胶囊，胶囊规格0.5 g，服用4粒/次，每天3次，日服用量为6 g，则添加质量比例为0.083%。如果同时添加2种衍生物，只需0.028%。以取样量 0.5 g，提取体积 100 mL计，非法添加组分浓度为1.4 μg/mL。

按法定方法［1］检测。分析柱：DIKMA C18（250 mm ×4.5 mm，5 μm）；柱温：35℃；流速：1.0 mL/min；进样量：20 μL；流动相：A为20 mmol/L乙酸铵用乙酸调节 pH值为 4.0，B为乙腈，A∶B 为56∶44；检测波长：225 nm。采集的混合对照品（各10 μg/mL）色谱图如图9所示。其中西布曲明峰的保留时间为7.605 min，酚酞峰与N-单去甲基西布曲明峰混在一起合成一个峰前半部分为酚酞，后半部分为N-单去甲基西布曲明，其保留时间为8.553 min，N，N-双去甲基西布曲明峰保留时间为11.481 min。可见：检测组分难以分离，且色谱图基线噪声较大。当对照品浓度为0.5 μg/mL时，则无法检出，如图 10，可能造成假阴性结果。且按法定之方法［1］，只有经液相色谱法检测为阳性的才需用液质法确证。液相色谱能否检出，直接关系到是否检出。因此，从改善分离度，提高检出限的目的出发，有必要重新建立色谱条件。

图9　　混合对照（各10 μg/mL）225 nm波长采集色谱图

3.2流动相的选择

流动相中改性剂的选择：原检验标准中采用的是pH值为4.0乙酸铵-乙酸缓冲液，而乙酸盐的UV截止波长为230～ 240 nm，在此波长以下检测，噪声会急剧增大，严重影响检出限；而磷酸盐在低于200 nm时基本无吸收，所以本法采用磷酸氢二钾-磷酸缓冲液。又因磷酸盐缓冲液与乙腈混合，很有可能产生盐析，危害色谱系统，故采用本法的“磷酸氢二钾-磷酸缓冲液-甲醇”流动相系统。事实也证明，“磷酸氢二钾-磷酸缓冲液-甲醇”流动相系统色谱图基线平稳，噪声小，有利于提高灵敏度得到较高的检出限（图1～ 8）。

3.3洗脱条件的选择

先试用等度洗脱的方式。以流动相：A为50 mmol/L磷酸氢二钾以磷酸调节pH值为 6.0，B为甲醇，A∶B为 25∶75等度洗脱，检测波长：225 nm。结果见图11～ 15，西布曲明对照与N-单去甲基西布曲明对照峰不能完全分离，且西布曲明对照、N-单去甲基西布曲明对照与N，N-双去甲基西布曲明对照峰柱效较低（n=2 000）。因此需采用梯度洗脱的方法，采用本法中的梯度洗脱方式，225 nm检测，采集的色谱图如图25所示，各成分的分离度、柱效（n＞ 10 000）均达到满意的效果。

图10　　混合对照（各0.5 μg/mL）225 nm波长采集色谱图

图11　　酚酞对照225 nm波长采集色谱图

图12　　西布曲明对照225 nm波长采集色谱图

图13　N-单去甲基西布曲明对照225 nm波长采集色谱图

图14　N，N-双去甲基西布曲明对照225 nm波长采集色谱图

图15　　混合对照225 nm波长采集色谱图

图16　　混合对照225 nm波长采集色谱图（梯度洗脱）

3.4检测波长及流动相pH的选择

试验表明，以各成分的紫外吸收光谱中的最大吸收波长检测，能得到最高的灵敏度。因此可选用检测波长：酚酞229 nm，西布曲明、N-单去甲基西布曲明、N，N-双去甲基西布曲明223 nm。但酚酞在检测波长223 nm与 229 nm下灵敏变化不大，为了简便可选用223 nm。

酚酞、西布曲明、N-单去甲基西布曲明、N，N-双去甲基西布曲明在酸性条件下易溶，因此流动相偏酸性。流动相酸性偏强，对西布曲明、N-单去甲基西布曲明、N，N-双去甲基西布曲明峰的洗脱明显增强，会使三个峰挤在一起，不易分离，为使分离度合适，流动相酸性不能太强。经试验比较了磷酸盐缓冲液pH值分别为4.0，5.0及6.0，结果采用本法以流动相A为50 mmol/L磷酸氢二钾以磷酸调节pH值为6.0，分离较好。

3.5梯度洗脱引起的基线漂移对检测灵敏度的影响

在用梯度洗脱进行高灵敏度的试验时，由于流动相组成的不断改变，引起流动相吸收值的不断改变，而产生基线漂移，这将大大增加检测的噪声，影响灵敏度。但综合图11～ 16的结果来比较，采用等度洗脱，西布曲明对照、N-单去甲基西布曲明对照与N，N-双去甲基西布曲明对照峰的理论塔板数在2 000左右，且不能完全分离；采用本法梯度洗脱后，西布曲明对照、N-单去甲基西布曲明对照与N，N-双去甲基西布曲明对照峰的理论塔板数分别为11 524，13 048，14 336，且基线完全分离。经试验，各成分检出限浓度为30 ng/mL，定量限浓度为50 ng/mL，接近液相色谱-质谱联用的检测水平。

综上所述，本法为一种灵敏度较高的检测减肥类中药制剂及保健食品中非法添加酚酞、西布曲明、N-单去甲基西布曲明、N，N-双去甲基西布曲明等4种成分的超高效液相色谱-二极管阵列联用的检测方法。

［1］ 国家食品药品监督管理局.药品检验补充检验方法和检验项目批准件［S］.批准件编号2012005.2012-08-01.

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Determination of Four Components Illegally Mixed into Traditional Chinese Medicine for Antiobesity and into Healthy Foods by UPLC-DAD

Tu Fenglian1，Wang Yuanfu2
（1 Traditional Chinese Medicine Hospital of Nanchang City Xinjian District，Jiangxi Nanchang 330100，China；2 Nanchang Institute for Food and Drug Control，330038）

Objective：To establish a UPLC-DAD method for determination of four components（phenolphthalein，sibutratmine，N-monodesmethylsibutramine，N，N-didesmethylsibutramine）illegally mixed into Traditional Chinese Medicines antiobesity and into healthy foods.Methods：The analysis was performed with a Phenomenex Luna C18（2）100A column（150 mm×2.00 mm，3 μm）using phosphate buffer（50 mmol/L dipotassium hydrogen phosphate，adjusted to pH 6.0 with phosphoric acid-methanol as mobile phase by gradient elution.The column temperature was 35℃，while the flow rate was 0.2 mL/min，and the injection volume was 5.0 μL.Diode array detector was used.Results：The detection limit of this method was 30 ng/mL，while the quantitation limit was 50 ng/mL，and the linear range was 50～ 1 000 ng/mL.The correlation coefficient of test results within the linear range was more than 0.99，and the average recovery rates were 96.0% ～ 101.2%.Conclusion：The developed method was simple，rapid，accurate，highly sensitive and highly specific，by which the results of rapid deter-mination of illegal additives in traditional Chinese medicines for antiobesity and healthy foods were superior to those by HPLC method in the current legal standard.

UPLC-DAD；Traditional Chinese Medicines for Antiobesity and Healthy Foods；Phenolphthalein；Sibutratmine；N-Monodesmethylsibutramine；N，N-Didesmethylsibutramine；Illegal Additive

10.3969/j.issn.1672-5433.2016.04.005

涂凤莲，女，主管药师。研究方向：临床药学、医院药学。E-mail：wanngels@sina.com汪元符，男，主管药师。研究方向：中药理论、药物检测及食品安全。通讯作者E-mail：wanngel@126.com

2016-01-11）