Tm值差异型不对称PCR方法的建立及其在分子诊断中的应用

饶华春，滕继云，刁　勇，宋沁馨，王立强，杨会勇*，周国华

(1.华侨大学 生物医学学院分子药物研究院，教育部分子药物研究中心，福建泉州362021；2.南京军区南京总医院药理科，江苏南京210002；3.中国药科大学 药物分析教研室，药物质量与安全预警教育部重点实验室，江苏南京210009)



Tm值差异型不对称PCR方法的建立及其在分子诊断中的应用

饶华春1，滕继云1，刁勇1，宋沁馨2,3，王立强1，杨会勇1*，周国华2*

(1.华侨大学 生物医学学院分子药物研究院，教育部分子药物研究中心，福建泉州362021；2.南京军区南京总医院药理科，江苏南京210002；3.中国药科大学 药物分析教研室，药物质量与安全预警教育部重点实验室，江苏南京210009)

摘要：多数分子诊断方法对靶基因的检测都是以单链DNA为基础的，如何获得大量和高质量的单链靶DNA分子一直是研究热点.以包含BRCA1基因上3个单核苷酸多态性(SNP)的DNA片段为研究对象，通过调整不对称扩增引物碱基序列组成(5′-端引入错配或加入锁核苷酸(locked nucleic acid，LNA))，使用相差10倍浓度来增加不对称引物间Tm值差异，改进扩增条件(添加增强剂的扩增缓冲液，不同退火温度的二阶循环扩增程序)后，进行不对称扩增来产生大量单链靶DNA产物.结果表明Tm差异型不对称PCR(Tm difference asymmetric PCR,TDA-PCR)可有效提高单链DNA分子产率，降低引物设计难度，也扩大了模板序列的适用范围.此外，还针对禽流感病毒H5N1的血凝素(haemagglutinin)HA基因保守序列进行不对称扩增，用获得的单链DNA为模板进行焦磷酸测序检测，所得结果与参考序列一致且无明显干扰信号.因此，采用Tm值差异型不对称PCR可使焦磷酸测序等分子诊断流程更为简便,成本更低,效率更高，具有很好的通用性和实用性.