吉非替尼亚稳态晶型的定量测定和转晶动力学研究

王　伟， 刘　红, 乔佛晓， 禹玉洪*

(1山西医科大学药学院药剂教研室，太原　030001; 2亚宝北京药物研究院; *通讯作者,E-mail:09010901qaz@163.com)



吉非替尼亚稳态晶型的定量测定和转晶动力学研究

王伟1,2， 刘红1, 乔佛晓2， 禹玉洪1,2*

(1山西医科大学药学院药剂教研室，太原030001;2亚宝北京药物研究院;*通讯作者,E-mail:09010901qaz@163.com)

摘要：目的为应用吉非替尼亚稳态晶型7，建立其定量测定方法并且研究其转晶动力学。方法利用热分析、傅里叶红外光谱和X射线粉末衍射法对亚稳态晶型7和稳态晶型1进行表征研究，并利用X射线粉末衍射法建立晶型定量检测方法，同时考察温度、湿度和光照对晶型7转晶的影响并在此基础上研究晶型7转晶动力学。结果晶型7和晶型1的平衡溶解度分别为 0.326 mg/ml和0.249 mg/ml，晶型7在6%-100%质量分数范围内线性关系良好。影响因素实验发现温度是影响亚稳态晶型7转晶的因素。通过计算晶型7的转晶度，拟合动力学方程，求得晶型7最佳转晶动力学方程为[1-(1-α)1/3]2=kt。结论X射线粉末衍射法适用于吉非替尼晶型含量的测定，利用所得定量检测方法和转晶动力学方程能够为亚稳态晶型7的生产和储存提供理论和数据支持，以便控制和保证晶型7的质量。

关键词：吉非替尼；X-射线粉末衍射；定量检测多晶型；固态转晶；动力学分析

药物多晶型是一个化合物在固体形态下存在多种晶型，最近的研究报道有机化合物多晶型现象是很常见的，大概超过一半的药物化合物存在多晶型现象[1-3]。由于化合物不同的晶型具有不同的形态、稳定性、溶解度和溶出度，所以不同的晶型可能影响生物利用度[4,5]。

药物多晶型一般按照其稳定性的不同分为三类：稳定型晶型、亚稳定型晶型、不稳定型晶型[6]。药物产品一般选择稳定型晶型[7]，但由于亚稳态晶型具有溶解度大、生物利用度高等特点，使得选择亚稳态晶型作为原料成为解决药物产品溶出慢、生物利用度低的一种方式[7-10]。因为亚稳态晶型具有更高活化能，其在储存和生产过程中会向稳态晶型转晶，所以虽然亚稳态晶型相比不稳定型晶型更稳定，但在研发生产过程中仍需要考虑并且控制亚稳态晶型转晶问题。

吉非替尼(结构式见图1)是用于治疗既往接受过化学治疗的局部晚期或转移性非小细胞肺癌，属于生物药剂学分类系统(BCS)Ⅱ类药物[11]。原研产品吉非替尼原料是稳定型晶型1[12]，亚宝北京药物研究院研究开发了一种吉非替尼亚稳态晶型(晶型7)[13],晶型7与最近Thorat等[14]报道的吉非替尼晶型一致。

为了考察亚稳态晶型的转晶现象，需要相应的晶型定量检测方法准确记录其在储存生产过程中的转晶情况。药物多晶型定量分析技术包括X射线粉末衍射(PXRD)、傅里叶变换红外光谱(FTIR)、热分析和拉曼光谱等[15-21]。定量分析固体药物多晶型需要考察每种检测技术的适用性，PXRD由于其使用样品量少、不破坏样品、操作快速方便等特点成为定量分析的常用方法[15,18,19]。利用晶型的定量检测方法可以研究其转晶动力学进而揭示晶体转晶规律，用于产品原料储存和生产过程的晶型质量控制[10]。

图1　吉非替尼结构式Figure 1　Chemical structure of gefitinib

本研究内容包括吉非替尼晶型7与晶型1的表征以及溶解度的测定，并利用X-射线粉末衍射法开发定量检测吉非替尼晶型1和7的方法。筛选了光照、湿度、温度、时间对吉非替尼晶型7转晶为晶型1的影响，并在此基础上研究吉非替尼亚稳态晶型7的转晶动力学，用于指导吉非替尼晶型7的生产和质量控制。

1材料

1.1药品与材料

吉非替尼晶型7(晶体粒径D90=30.52 μm)依据专利CN103896863A实验室制备，经PXRD检测图谱对比专利验证[13]；吉非替尼晶型1(晶体粒径D90=32.39 μm)实验室转晶制备，经PXRD检测图谱对比原研专利WO 0372108A1验证[12]。

1.2仪器

METTLER TOLEDO ab204-l分析天平(梅特勒-托利多，瑞士)；X-射线粉末衍射仪(PXRD) PANalytical X’Pert PRO PW3040/60 X-ray (帕纳科, 荷兰) 采用Cu靶，工作电压40 kV，电流40 mA，2θ角为4°-40°，波长1.540 60 Å，步长(2θ)0.017°。粉末样品(约135 mg)装在样品池厚度约1 mm的玻璃样品架中，数据分析使用X’Pert HighScore软件；傅里叶变换红外光谱(FTIR) Varian 640-IR(Varian 美国)，采用KBr压片法，扫描范围400-4 000 cm-1，分辨率4 cm-1；差示扫描量热法(DSC)DSC 1(梅特勒-托利多，瑞士) 样品质量4 mg；升温速率10 ℃/min；N2气流量50 ml/min；热重分析(TGA) TGA/DSC 1 (梅特勒-托利多，瑞士) 氧化铝坩埚放置，升温速率10 ℃/min；N2气流量50 ml/min；粒径测定仪 BT-9300S(百特仪器有限公司，丹东市)；发射扫描电子显微镜(SME)Hitachi S-4800(日立，日本)15 kV加速电压；烘箱 101-3AB (泰思特，天津)；冰箱KK25V61TI (西门子，德国)；恒温恒湿箱 CLIMACELL707 (MMM 德国)。

2方法和结果

2.1吉非替尼晶型1和7的表征研究和溶解度测定

晶型1和7的溶解度测定采用平衡法，分别加入过量的晶型1和晶型7于两份相同的磷酸盐缓冲液中(pH 4.5；0.05 mol/L)，保持在37 ℃搅拌1 h，静置0.5 h，用0.2 μm的微孔滤膜过滤，滤液经过适当的稀释经高效液相色谱法测定含量。结果显示实验条件下晶型7和晶型1的平衡溶解度分别是 0.326 mg/ml和0.249 mg/ml，符合亚稳态晶型比稳态晶型溶解度大的一般规律。

本实验通过电子显微镜观察吉非替尼晶型1和7表征可知，晶型7呈现薄片状，而晶型1呈现不规则块状(见图2)，两种晶型形态差异大，易于区分。

图2　晶型7和晶型1的电镜图Figure 2　SEM micrographs of form 7 and form 1

热分析表征实验结果见图3，差示扫描量热(DSC)图谱中向下的峰为放热峰，向上的峰为放热峰。首先根据两个晶型的热重分析(TGA)图谱在全段升温过程中无失重，确认两种晶型非含溶剂晶型，图3A中DSC图谱结果显示晶型7快速持续升温过程中在99-116 ℃范围内出现吸热峰，这段时间晶型7转晶为晶型1。晶型7的DSC图中有两个放热峰：大的放热峰(194 ℃)与晶型1的熔点一致，说明晶型7转晶为晶型1，小的放热峰(约170 ℃)为快速升温过程中少量残留晶型7的熔点。

图3　晶型7和晶型1的差示扫描量热(DSC)与热重分析(TGA)图Figure 3　DSC and TGA curves of gefitinib form 7 and form 1

本研究通过傅里叶红外表征图谱发现，晶型7在波数2 000-2 500 cm-1段有倒峰，为制样过程中水分的影响导致(见图4)，而热分析结果显示两种晶型都无结晶水，所以晶型1和晶型7的红外图谱差别小，只有部分峰的强度有很小差异。

图4　晶型1和7的红外谱图Figure 4　FTIR spectra of gefitinib form 1 and 7

本实验通过X射线粉末衍射仪表征得两种晶型合并的PXRD图谱，结果显示晶型1和7的PXRD图谱差异明显，晶型7的特征峰如图中箭头所示包括最强峰6.42°(I/I0=100%),以及12.89°,14.01°和15.27°等(见图5)。晶型1的特征峰如图中箭头所示包括最强峰7.09°(I/I0=100%),以及15.82°和19.33°等(见图5)。结果显示晶型1图谱符合专利WO 0372108A1，晶型7图谱符合专利CN103896863。最终通过比较选择PXRD用于晶型7的定量计算。

2.2吉非替尼晶型7转晶的影响因素

本研究考察了不同时间光照(隔绝方法铝箔包裹)、湿度(隔绝方法压铝盖密闭)、温度对晶型7转晶的影响，实验设计5个实验组见表1。

实验结果显示30 d内实验组1中粉末由白色逐渐变为浅黄色，实验组2，3，4，5颜色无明显变化。PXRD图谱显示实验组1，2，5中晶型7有相同的极微量转晶约1%-2%。实验组3和4发现明显的转晶现象，并且随着温度升高，转晶速度越快，随着时间持续，转晶程度越大。根据实验组1和2与实验组5空白组的结果相比，说明虽然光照影响亚稳态晶型的颜色，但不影响转晶速率，湿度对转晶同样没有影响。根据实验组3，4，5结果说明温度是转晶的影响因素。

图5　吉非替尼晶型1和7的PXRD谱图Figure 5　PXRD patterns of gefitinib form 1 and form 7

表1不同影响因素对晶型的影响设计方案

Table 1The design on effect of different factors on crystal

实验组光照相对湿度温度温度1(4500±500)lx干燥密闭常温常温2避光92.5% 常温常温3避光干燥密闭60℃常温4避光干燥密闭常温80℃5避光干燥密闭常温常温

常温：25℃±2℃

2.3定量检测标准曲线的绘制

吉非替尼晶型1分别按质量百分比(0，0.1%，0.2%，0.4%，0.6%，0.8%，1%，2%，4%，6%，8%，10%，20%，40%，60%，80%，100%)分别与晶型7在稳定环境下[(18±2)℃;40%±5%RH(相对湿度)]混合制备。称量每份样品约135 mg于样品槽中，于X射线粉末衍射仪中重复检测三次，分别取其平均值。由于分析计算时图谱峰面积比图谱峰强度更准确，所以本实验选取峰面积用于标准曲线的绘制[18,19]。选择晶型1的2θ=7.09°特征峰面积用于指示晶型7转晶量。结果显示标准曲线显示出良好的线性关系，线性方程为y=7.071 2x+0.067 4，R2=0.999 7(见图6)。

2.4分析方法的验证和误差分析

分别制备质量百分比30%，50%，70%晶型1检测3次验证准确度，分别制备质量百分比20%，40%，60%晶型1检测6次验证精密性，检测限(LOD)和定量限(LOQ)分别通过公式LOD=3.3σ/S，LOQ=10σ/S(σ为标准曲线的标准误，S为标准曲线的斜率)计算求得，结果与谱图一致。

制备50%晶型1，不重新填装样品检测6次验证仪器重复性。每次重新填装样品检测6次验证制样重复性。1日内重新填装检测6次检测验证日内操作重复性。6日间重新填装检测6次验证日间操作重复性。分析方法的验证结果见表2，最终晶型7的定量测定标准曲线线性范围为6%-100%。

图6　利用PXRD检测混合粉末中晶型1含量的标准曲线Figure 6　Calibration curve for content of gefitinib polymorphic form 1 in mixed powder by PXRD

表2分析方法验证参数汇总

Table 2Validation of parameters

验证项验证参数准确度(%)97.0-102.0精密度RSD(%)1.5-3.5检测限(%)2.0定量限(%)6.0仪器稳定性RSD(%)1.0制样重复性RSD(%)2.1日内操作重复性RSD(%)3.0日间操作重复性RSD(%)6.0

2.5不同温度下吉非替尼晶型7的转晶程度

由于晶型7转晶影响因素实验发现在较宽的温度范围内晶型7都转晶，所以考察晶型7纯品在(-20，-10，0，10，20，30，40，60，80，100 ℃)条件下分别在5，10，15，20，25，30，35，40 d的转晶情况。-20，-10，0，10 ℃实验样品分别放置于冰箱中;20，30 ℃样品分别放置于加速实验箱;40，60，80，100 ℃样品分别放置于烘箱中。通过定量检测方法计算各温度条件下不同时间段的转晶率。

实验结果显示-20，-10，0，10，20 ℃条件下晶型7在40 d内没有检测到转晶，30 ℃及以上温度越高转晶速度越快，晶型7在不同温度条件下转晶率结果见表3。

表3不同时间段晶型7转晶度

Table 3The rate of transformation of polymorph 7 at different temperatures

温度晶型1的含量(%)5d10d15d 20d25d30d35d40d30℃1.86*2.122.37*2.402.542.802.892.9140℃1.892.17*2.472.632.782.923.043.1660℃2.25*2.883.654.685.205.275.556.3680℃11.3621.4535.6345.0450.5857.2458.7163.60100℃96.80102.86100.02102.95*100.50103.5997.80*102.08

*三次检测数据差异>10%

2.6吉非替尼晶型7的转晶动力学

研究晶型7在不同温度条件下转晶动力学，可以将表3的数据拟合文献[22-24]报道中总结的不同固体晶型转晶动力学方程，筛选最佳动力学方程，结果见表4。

表4固态反应机理的动力学方程的相关系数(R2)

Table 4Correlation coefficient of different kinetic model(R2)

动力学方程30℃40℃60℃80℃lnα/(1-α)=kt0.9380.9340.9080.895[-ln(1-α)]1/2=kt0.9500.9520.9360.970[-ln(1-α)]1/3=kt0.9460.9460.9280.951-ln(1-α)=kt0.9580.9660.9550.9791-α=kt0.9580.9650.9630.9381-(1-α)1/2=kt0.9580.9650.9540.9611-(1-α)1/3=kt0.9580.9650.9540.968α2=kt0.9690.9860.9690.985(1-α)ln(1-α)+α=kt0.9580.9640.9530.900[1-(1-α)1/3]2=kt0.9690.9860.9680.989

α(%)：晶型1的含量；k(%/d)：反应速率常数；t(d)：转晶时间；R2：相关系数

根据表4可知公式[1-(1-α)1/3]2=kt的拟合效果最好，将表3数据代入公式，得到各温度点转晶速率方程，结果见表5。

现已求得30，40，60，80 ℃条件下晶型7的转晶动力学方程，根据转晶动力学求算晶型7在30，40，60，80 ℃条件下一年有效期的转晶情况，结果见表6。结果显示晶型7在1年后30 ℃和40 ℃条件下转晶量低于10%，仍然有效，当高于60 ℃转晶量则超过10%，产品失效。

表5晶型7在不同温度下的转化动力学方程

Table 5The transformation kinetic equation of form 7 at different temperatures

温度动力学方程30℃[1-(1-α)1/3]2=1.67×10-6t+3.36×10-540℃[1-(1-α)1/3]2=2.05×10-6t+3.42×10-560℃[1-(1-α)1/3]2=1.13×10-5t-3.64×10-680℃[1-(1-α)1/3]2=2.37×10-3t-1.45×10-2

表6晶型在不同温度条件下1年有效期的转晶计算值

Table 6The calculated values of transformation of form 7 at different temperature in a year

温度晶型1的含量(%)30d60d180d360d30℃2.724.015.387.3740℃2.914.375.908.1160℃5.399.2512.9217.9380℃55.7782.9895.4199.94

3讨论

由于热分析实验中晶型7在升温过程中转晶，傅里叶红外检测晶型1和7的图谱相似都不利于定量分析，而差别明显的晶型1和7的PXRD图谱适用于定量分析。并且依据仪器稳定性RSD为1.0%，可以确认仪器运行稳定，数据收集准确。制样重复性降低是由于晶体在PXRD检测中正常择优效应的影响，并且日间日内重复性的降低除了由于择优效应还有晶型7随时间转晶的影响，但误差分析结果显示都在可接受范围内。所以选择PXRD作为吉非替尼晶型定量测定的检测方法。

根据DSC实验图谱结果显示，吉非替尼晶型7转晶温度低于两种晶型熔点，所以晶型7的转晶过程属于纯固相转晶。同时根据Thorat等[14]报道中晶型1和7的晶胞结构，可知晶型7转晶为晶型1属于重构式晶型转变，而重构式晶型转晶速度缓慢[25]与实验结果符合。为了控制吉非替尼亚稳态晶型7的质量，保证其在有效期内含量符合标准，其存储和生产过程应避免高温，最好控制在30 ℃以下，并且尽量避免直接光照。满足以上条件后，相比上市晶型1具有高溶解度的吉非替尼晶型7会有更大的应用前景。

参考文献：

[1]Stahly GP.Diversity in single-and multiple-component crystals.The search for and prevalence of polymorphs and cocrystals[J].Cryst Growth Des,2007,7(6)：1007-1026.

[2]Allesø M,Van Den Berg F,Cornett C,etal.Solvent diversity in polymorph screening[J].J Pharm Sci,2008,97(6):2145-2159.

[3]张伟国,刘昌孝.多晶型药物的生物利用度研究概况[J].天津药学,2007,19(2):59-61.

[4]Matsuda Y,Tatsumi E.Physicochemical characterization of furosemide modifications[J].Int J Pharm,1990,60(1):11-26.

[5]Bond AD.Polymorphism in molecular crystals[J].Curr Opin Solid State Mater,2009,13(3):91-97.

[6]Vippagunta SR,Brittain HG,Grant DJW.Crystalline solids[J].Adv Drug Delivery Rev,2001,48(1):3-26.

[7]U.S.Food and Drug Administration.Q6A specifications:test procedures and acceptance criteria for new drug substances and new drug products:chemical substances,Fed.Regist，65(2000)83041-83063[EB/OL].http://www.ich.org/fileadmin/Public Web Site /ICH Products/Guidelines/Quality/Q6A/Step4/Q6Astep4.pdf.

[8]Zhang GG,Law D,Schmitt EA,etal.Phase transformation considerations during process development and manufacture of solid oral dosage forms[J].Adv Drug Delivery Rev,2004,56(3):371-390.

[9]Tang XC,Pikal MJ,Taylor LS.The effect of temperature on hydrogen bonding in crystalline and amorphous phases in dihydropyrine calcium channel blockers[J].Pharm Res,2002,19(4):484-490.

[10]张奇,梅雪锋.固体药物的转晶现象[J].药学学报,2015,50(5):521-527.

[11]Brittain HG.Profiles of drug substances,excipients and related methodology,Volume 39,Chapter Five,Gefitinib[M].New York:Academic Press,2014:239-264.

[12]Gilday JP,Graham AS,Ymén BI,etal.Novel crystalline forms of the anti-cancer compound zd1839:12/561,835[P].2009-09-17.

[13]彭涛,任武贤,吕立天,等.抗癌化合物ZD1839的新晶型及其制备方法:2013107224598[P].2012-12-26.

[14]Thorat SH,Patwadkar MV,Gonnade RG,etal.Capturing a novel metastable polymorph of the anticancer drug gefitinib[J].Cryst Eng Comm,2014,16(37):8638-8641.

[15]Varasteh M,Deng Z,Hwang H,etal.Quantitative determination of polymorphic impurity by X-ray powder diffractometry in an OROS®formulation[J].Int J Pharm,2009,366(1):74-81.

[16]Bugay DE.Characterization of the solid-state:spectroscopic techniques[J].Adv Drug Delivery Rev,2001,48(1):43-65.

[17]Blanco M,Peguero A.Analysis of pharmaceuticals by NIR spectroscopy without a reference method[J].TrAC Trends Anal Chem,2010,29(10):1127-1136.

[18]Tiwari M,Chawla G,Bansal AK.Quantification of olanzapine polymorphs using powder X-ray diffraction technique[J].J Pharm Biomed Anal,2007,43(3):865-872.

[19]Qiu J,Li G,Sheng Y,etal.Quantification of febuxostat polymorphs using powder X-ray diffraction technique[J].J Pharm Biomed Anal,2015,107:298-303.

[20]Wartewig S,Neubert RHH.Pharmaceutical applications of Mid-IR and Raman spectroscopy[J].Adv Drug Deliv Rev,2005,57(8):1144-1170.

[21]Lehto VP,Tenho M,Vähä-Heikkilä K,etal.The comparison of seven different methods to quantify the amorphous content of spray dried lactose[J].Powder Technol,2006,167(2):85-93.

[22]Huberty J,Xu H.Kinetics study on phase transformation from titania polymorph brookite to rutile[J].J Solid State Chem,2008,181(3):508-514.

[23]Kato F,Otsuka M,Matsuda Y.Kinetic study of the transformation of mefenamic acid polymorphs in various solvents and under high humidity conditions[J].Int J Pharm,2006,321(1):18-26.

[24]汪晶.氯吡格雷硫酸氢盐多晶型研究[D].无锡:江南大学,2013.

[25]龚俊波,王琦,董伟兵,等.药物晶型转化与控制的研究进展[J].化工学报,2013,64(2):385-392.

作者简介：王伟，男，1989-03生，硕士，E-mail:09010901qaz@163.com

收稿日期：2016-04-16

中图分类号：R969

文献标志码：A

文章编号：1007-6611(2016)07-0598-06

DOI：10.13753/j.issn.1007-6611.2016.07.004

Quantification and crystal transformation kinetics of gefitinib metastable polymorph

WANG Wei1,2, LIU Hong1, QIAO Foxiao2， YU Yuhong1,2*

(1CollegeofPharmacy,ShanxiMedicalUniversity,Taiyuan030001,China；2BeijingResearchInstituteofYabaoPharmaceuticalGroup;*Correspondingauthor,E-mail:09010901qaz@163.com)

Abstract：ObjectiveTo establish a quantitative method of a metastable polymorph of gefitinib(form7) and investigate its crystal transformation kinetics. Methods The nature of gefitinib polymorphs was characterized using powder X-ray diffraction, thermal analysis and fourier transform infrared spectroscopy. Method was established to determine the gefitinib polymorphs using powder X-ray diffraction technique. At the same time, the effects of temperature, humidity and light on the transformation of form 7 were examined and the kinetic equation of transformation of form 7 was explored. ResultsThe equilibrium solubility of gefitinib form 7 and form 1 was 0.326 mg/ml and 0.249 mg/ml, respectively. Form 7 showed an excellent linear relationship in the mass fraction of 6%-100%. The temperature was the key factor for the transformation of form 7. The most suitable kinetic equation was [1-(1-α)1/3]2=kt by calculating the rate of transformation of form 7 and fitting it to solid-state reaction models.ConclusionPowder X-ray diffraction technique is feasible for the quantitative analysis of mixtures of gefitinib polymorphs. The quantitative method and crystal transformation kinetics equation can provide a theoretical and computational support for the production and storage of the metastable polymorph of gefitinib(form7) to ensure the quality of form 7.

Key words:gefitinib;powder X-ray diffraction；quantitative analysis of polymorphs;solid-state transformation;kinetic analysis