GC—MS/MS同位素内标法测定肉制品中N—二甲基亚硝胺

周佳 孙嘉茵 李宇茜 唐维英 徐小平

摘 要：采用同位素内标定量，建立一种快速、准确测定各种肉制品N-二甲基亚硝胺的GC-MS/MS法。样品中加入D6-N-二甲基亚硝胺内标，经水蒸气蒸馏、二氯甲烷提取、分离、浓缩，用多反应监测模式（MRM）进样分析。色谱柱为HP-Innowax毛细管柱（30 m×0.32 mm，0.25 μm），氦气为载气，氮气为碰撞气，流量为1.4 mL/min。结果表明：该方法检测范围在10～300 ng/mL内，线性关系良好y=77.16x-500.16（r2=0.999 6），精密度RSD为2.36%；回收率为82.9%～99.5%，检出限0.2 μg/kg。对4种不同来源的肉制品共40批次进行检测，检出13批次，但均未超过限量（3 μg/kg）。该方法灵敏、简便、准确、重复性好，可作为肉制品中N-二甲基亚硝胺检测的好方法。

关键词：N-二甲基亚硝胺；同位素内标；GC-MS/MS；多反应监测模式；优化

文献标志码：A 文章编号：1674-5124（2016）09-0046-04

0 引 言

N-二甲基亚硝胺是一种很强的化学致癌物质，有40多种动物包括灵长类易于感染N-亚硝胺引起癌变[1-2]，肉制品中大多会添加护色剂亚硝酸钠，现未找到合适的替代物，而亚硝酸盐在制作肉过程中很容易和次级胺类物质反应产生致癌物质N-亚硝胺类物质，一次摄入过多会损伤肝脏和破坏血小板，出现严重的急性中毒症状，长期食用会导致肝硬化，新鲜的肉一般不含N-亚硝胺，而腌制、卤制的肉常常含有N-亚硝胺[3-5]，又以N-二甲基亚硝胺检出率最高[6]，一般会对肝、肾、肺产生致癌性作用，在培根、腌肉、香肠等肉制品中经常被检出，国家对肉制品中N-二甲基亚硝胺的限量是3.0 μg/kg[7]，所以建立高灵敏度，高准确性，低检出限的方法很有必要。前处理方面，笔者发现由于N-二甲基亚硝胺具有半挥发性，浓缩时很容易损失，尝试加入同位素内标D6-N-二甲基亚硝胺，使定量更加准确；检测方式方面，目前有关N-亚硝胺的检测方法主要有GC-MS选择离子扫描模式（SIM）测定[8-11]，现在国标方法[12]第一法所提及的气相-热能分析仪不普及，很多实验室不适用，笔者曾用SIM进行检测，发现基质干扰太大，常出现样品中加入標液却无法定性的情况，准确度极差，本实验在这个基础上进行改进，采用GC-MS/MS同位素内标法多反应监测模式（MRM）检测肉制品中N-二甲基亚硝胺，基质干扰小，能有效地对目标物定性定量，灵敏度高。

1 材料和方法

1.1 主要仪器

Aglilent 7890A-7000B气相色谱-质谱质谱联用仪（美国安捷伦仪器公司）；色谱柱：HP-Innowax毛细管柱30 m×0.32 mm，0.25 μm[12]（美国安捷伦仪器公司）；电子天平（Sartorius，CPA 225D），旋转蒸发仪（Buchi，R-215）；漩涡振荡器（IKA，MS3digital）；超声清洗机（Auto science，AS5150B）；高速离心机（Eppendorf，Centrifuge 5810R）。

1.2 试 剂

二氯甲烷（色谱级）、氯化钠、硫酸、超纯水；N-二甲基亚硝胺标液（Accustandard：Lot：214071210；浓度：100.8 μg/mL）；D6-N-二甲基亚硝胺（CDN ISOTOPE Lot：X323P9，纯度：99.5%），硫酸溶液：90 mL超纯水，缓慢加入30 mL浓硫酸，混匀，放至室温，即得。

1.3 标准溶液及内标溶液的配制

N-二甲基亚硝胺标准工作液：精密量取N-二甲基亚硝胺标液0.1 mL，置于10 mL棕色量瓶中，用二氯甲烷定容至刻度，摇匀，即得（质量浓度为1.008 μg/mL）。D6-N-二甲基亚硝胺标准工作液：精密称取D6-N-二甲基亚硝胺标准品10.14 mg，置于50 mL棕色量瓶中，用甲醇定容至刻度，得D6-N-二甲基亚硝胺储备液（质量浓度约为0.2 mg/mL，4 ℃以下保存，3个月内使用）；精密量取上述储备液100 μL，置10 mL量瓶中，二氯甲烷稀释并定容至刻度，摇匀，得内标使用液（2 μg/mL，4 ℃以下保存，1周内使用）。

1.4 色谱条件

1.4.1 GC条件

进样口温度：250 ℃；进样量：2 μL，进样方式：不分流；载气：高纯氦气，流量：1.4 mL/min；升温程序：50 ℃保持4 min，以10 ℃/min升至160 ℃，270 ℃后运行3 min。

1.4.2 MS/MS条件

电离方式为电子轰击电离（EI），电离能量为70 eV； 离子源温度：230 ℃；接口温度：280 ℃；四级杆温度：150 ℃；碰撞气：氮气；溶剂延迟时间：5 min；扫描模式：MRM（多反应监测），定量离子m/z（质荷比）74>44，定性离子m/z 74>42；内标定量离子m/z 80>50；碰撞能量：m/z 74>44为5 V，m/z 74>42为20 V；m/z 80>50为10 V。

1）用Scan模式确认

N-二甲基亚硝胺的保留时间及质谱图相关信息（见图1、图2），图中可以确认N-二甲基亚硝胺的保留时间为8 min。

2）离子筛选及MRM模式电压的选择

在Product ion模式下固定m/z 74的母离子，分别用5，10，20，30 V电压进行碰撞，由于N-二甲基亚硝胺的分子量较小m/z 74，可以选择的碎片离子不多，有44、43、42、30，考虑到30分子量太小，容易受干扰，没有再优化，如图3所示。

在MRM模式下分别选用电压5，10，20，30 V对m/z 74>44、m/z 74>42、m/z 74>43进行筛选，发现m/z 74>43响应比较低，并且旁边易出现干扰峰（如图4所示），最终选定m/z 74>44和m/z 74>42，同时也选择了m/z 74>44为5 V，m/z 74>42为20 V，m/z 74>44响应较m/z 74>42高，m/z 74>44为定量离子，响应好、干扰小。

1.5 样品的预处理

取样品约50 g，精密称定，加入内标使用液100 μL，使与样品混匀，置于水蒸气蒸馏装置中，加入50 mL水，摇匀，在蒸馏瓶中加入60 g氯化钠，充分摇动使氯化钠溶解，将蒸馏瓶与水蒸气发生器及冷凝管连接好，在锥形瓶中加入30 mL二氯甲烷及少量冰块，收集约200 mL的馏出液，在锥形接收瓶中加入40 g氯化钠和3 mL硫酸溶液，搅拌，使氯化钠全部溶解，转移至分液漏斗中，振摇提取，静置分层，分取二氯甲烷层，40 ℃以下旋转至近干，用二氯甲烷转移并定容至1 mL。

1.6 方法评价

1.6.1 标准曲线的绘制

分别量取浓度约为1 μg/mL的N-二甲基亚硝胺标准工作液（10，30，50，100，150，200，300 μL）及内标使用液各100 μL，加二氯甲烷配制成浓度分别为10.08，30.24，50.4，100.8，151.2，201.6，302.4 ng/mL的标准工作液。

将制备好的N-二甲基亚硝胺标准测定液分别注入GC-MS/MS，记录色谱图，以峰面积为纵坐标，以N-二甲基亚硝胺得浓度（ng/mL）为横坐标绘制标准曲线为y=77.16x-500.16（r2=0.999 6），结果表明N-二甲基亚硝胺浓度在10～300 ng/mL范围内线性良好，如图5所示。

1.6.2 方法精密度试验

用该方法对同一样品进行反复测定（n=6），考察含量的精密度，RSD为2.36%，结果符合精密度要求，如表1所示。

1.6.3 准确度考察

称取空白样品6份，进行3个浓度的加标回收试验，分别加入N-二甲基亚硝胺标准工作液（1.008 μg/mL）30，100，150 μL，形成低中高单个浓度，测定计算回收率，结果如表2所示。

1.6.4 检出限

称取空白样品50 g，置于水蒸气蒸馏装置的蒸馏瓶中，加入N-二甲基亚硝胺标准使用液（1.008 μg/mL）10 μL及内标使用液100 μL，使与样品混匀，加入水50 mL，混合均匀，加入氯化钠60 g，照1.4样品处理操作，制备检出限工作液，注入GC-MS/MS，测得信噪比，按S/N=3∶1计算，折算N-二甲基亚硝胺检出限为0.2 μg/kg。（检出限（μg/kg）=检出限工作液浓度（ng/mL）×稀释体积（mL）/取样量（g）×3/测得信噪比×1 000/1 000）。

1.7 专属性

分别注射空白基质溶液和对照品溶液，N-二甲基亚硝胺保留均较好，空白基质未见干扰，对照品与溶剂空白反复进样也未见交叉污染，专属性较好，如图6所示。

1.8 测 定

将样品測定液注入GC-MS/MS得到峰面积，从标准曲线中查出相应得浓度（ng/mL），根据稀释倍数和称样量可与算出样品得含量（μg/kg），结果如表3所示。

2 结果与讨论

2.1 样品前处理的选择

考虑到食品基质复杂，为得到准确的结果，选取4种不同来源肉制品（包括猪肉、牛肉、鸡肉、鸭肉），采取不同的提取方式，考察溶剂提取和蒸馏提取，用二氯甲烷溶剂超声提取时发现，由于肉制品（如猪肉）脂肪含量可以达到90%以上，在浓缩时，提取液会出现一块块固状的油脂，实验无法继续，本实验采用水蒸汽蒸馏方式，油脂、蛋白质无法随目标物蒸馏出来，能够获得理想的提取效果。

2.2 肉制品中N-二甲基亚硝胺的检测常见问题与采用GC-MS/MS检测的优势

曾用单气质SIM模式进行测定，由于N-二甲基亚硝胺的分子量（74）太小，容易受多种分子离子干扰，食品基质复杂，基质效应特别明显，常常出现加入标准液却定性不了，造成定性上的误差，用GC-MS/MS的MRM模式，排除了基质带来的干扰，灵敏度更高。

2.3 采用内标法的优势

在进行前处理时，发现样品浓缩及液液萃取过程很容易使目标物流失，采用D6-NDMA标准品为内标，选取内标定量离子m/z 80>50，可减少外标法对回收率的影响，使目标物定量更加准确。

2.4 样品测定

应用本方法对4中不同来源基质样品（包括猪肉制品20批次、牛肉制品10批次、鸡肉制品5批次、鸭肉制品5批次）共40批进行分析，检测含有NDMA 13批次，含量在0～1 μg/kg之间，均未超过国家规定的限量3.0 μg/kg。

3 结束语

NDMA食品安全限度值比较低，为了达到检测目的，样品取样量大，本方法保留国标中水蒸汽蒸馏法进行前处理，表面上效率比较低，但是由于样品取样量大，肉制品基质复杂，简单的有机溶剂提取不太现实，后期净化压力极大，而采用水蒸汽蒸馏能有效除去大部分的杂质，并且对环境影响较小，对操作人员友好。本法采用水蒸汽蒸馏，同位素标记，建立GC-MS/MS检测N-二甲基亚硝胺的新方法，结果表明，N-二甲基亚硝胺可通过GC-MS/MS的MRM模式，以同位素内标法被快速、灵敏的良好分离检测，是肉制品中N-二甲基亚硝胺高效检测的较好方法，可适用于日常食用肉制品的质量监控，提高人们的食肉安全性。

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（编辑：徐柳）