苹果园鳞翅目夜蛾科DNA条形码鉴定

武宇鹏，武春生，陆俊娇，杨　静，朱朝东*

(1.太原科技大学，太原030024;2. 中国科学院动物研究所动物进化与系统学院重点实验室，北京100101;3. 山西省农业科学院植物保护研究所，太原 030031)



苹果园鳞翅目夜蛾科DNA条形码鉴定

武宇鹏1, 2，武春生2，陆俊娇3，杨静3，朱朝东2*

(1.太原科技大学，太原030024;2. 中国科学院动物研究所动物进化与系统学院重点实验室，北京100101;3. 山西省农业科学院植物保护研究所，太原 030031)

为了检验DNA条形码在鳞翅目夜蛾科蛾类鉴定中的可行性，本文对采自北京昌平苹果园内的夜蛾科14种71头蛾类标本分别提取了DNA，并扩增了线粒体cox1及核基因28S，利用系统发育树、遗传距离、阈值等方法进行了鉴定和比较分析。同时，检验了目前BOLD系统的鉴定成功率。实验表明，基于cox1基因和BOLD系统的鉴定成功率达到了100%，而基于28S则很低，为64.8%。用不同方法构建的系统发育树，鉴定结果均相同。93%的种内遗传距离小于1%，94%的种间遗传距离为大于3%，种内种间的遗传距离形成明显的3%阈值现象。

果园;夜蛾科;DNA;条形码

鳞翅目Lepidoptera夜蛾科Noctuidae种类绝大多数是农、林业害虫，世界范围分布约3.5万多种 (Poole, 1989)。与大多数鳞翅目其他种类一样，夜蛾科主要在幼虫时期危害寄主，虽然一些典型的害虫在幼虫时期也能够鉴定，但大部分主要依靠成虫的形态特征。而蛾类幼虫的形态特征不易把握，鉴定很困难，如果在幼虫时期不能及时准确鉴定，往往会贻误防治适期，造成害虫爆发。近年来，昆虫分类学家队伍不断缩减，田间病虫害的识别大多靠基层工作人员的经验判断，结果似是而非，准确性大大降低。

2003年，加拿大生物学家Hebert提出利用cox1基因(线粒体细胞色素氧化酶亚基I基因)对物种进行分类学鉴定，如同超市里的条形码一样，称之为DNA条形码(DNA Barcoding)(Herbertetal., 2003; 2004a; 2004b)。DNA条形码技术可在物种生长发育的任一阶段，对物种进行鉴定，目前已在灵长类、兽类、爬行类、鱼类、鸟类、昆虫、植物等多个种类和领域中得到了广泛研究和应用 (Hebertetal., 2004b; Lorenzetal., 2005;Wardetal., 2005; Vencesetal., 2005; Hajibabaeietal., 2006; Kressetal., 2007; Kumaretal., 2007; Burnsetal., 2008; Smithetal.，2008)。随着DNA条形码研究的不断深入开展，2007年加拿大圭尔夫大学正式筹建生命条形码数据库系统 (Barcode of Life Data Systems, BOLD)。该数据库不仅包括DNA序列信息,也包括完整的物种描述、地理分布、标本图片等信息。利用BOLD系统可实现对物种的快速鉴定。但目前，尚缺乏对BOLD系统鉴定成功率的研究。利用DNA条形码技术对蛾类幼虫进行快速鉴定，对农业生产意义重大。但目前通用的DNA条形码cox1基因是否通用于一切物种尚存在争议，是否有必要再增加一个基因片段来保证鉴定的准确性尚无定论。

本文用不同的计算方法，基于线粒体cox1基因及核基因28S对采自果园内的夜蛾科15种71头蛾类标本进行了鉴定和比较分析，基于cox1基因计算并讨论了种内种间遗传距离。同时，检验了BOLD系统对本文所采集的71头标本序列的鉴定成功率。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1标本来源

71头夜蛾科标本采自北京市昌平区王家园果园(40°10.769′N， 116°2.628′，海拔164 m)。

1.1.2试验试剂和试验耗材

DNA提取试剂盒为北京全式金生物技术有限公司。PCR试剂使用TIANGEN天根生化科技有限公司生产的PCR MasterMix。

1.2方法

1.2.1标本采集和处理

利用高压汞灯诱集夜蛾成虫，然后采用低温冷冻致死，取一侧后足，用无水乙醇浸泡，置于-20℃冰箱保存。冷冻致死的标本用标本夹展翅，以便进行形态鉴定。

1.2.2DNA 提取

将浸泡于无水乙醇中的后足取出，晾干，分成2-3段，放在1.5 μL的离心管中。按照DNA提取试剂盒使用手册的说明进行总DNA提取。抽提的DNA溶于200-300 μL的AE缓冲液，并置于-20℃冰箱保存备用。

1.2.3PCR扩增和测序

线粒体cox1扩增引物为通用引物 LCO1490(5′-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3′)和 HCO2198(5′-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATC A-3′)(Folmeretal., 1994)。核基因28S扩增引物为通用引物 28SU1(5′-GACTACCCCCTGAATTT AAGCAT-3′) 和 28SD1 (5′-GACTCCTTGGTCCGTG TTTCAAG-3′) (Kimetal., 2000)。反应体系均为25 μL，其中上下游引物各0.5 μL，PCR MasterMix 12.5 μL，DNA模板3 μL，ddH2O 8.5 μL。取 3 μL PCR扩增产物使用1%的琼脂糖胶电泳检验。Cox1扩增反应条件为：预变性94℃ 2 min，变性94℃ 1 min，退火53℃ 45 s，延伸72℃ 1 min,行35个循环。28S扩增反应条件为：预变性94℃ 2 min，变性94℃ 1 min，退火58℃ 45 s，延伸72℃ 1 min, 行35个循环。PCR产物测序由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。

1.2.4序列比对及数据分析

所得的71条cox1样本序列进行校对后，在BOLD系统(http://www.barcodinglife.com)中进行鉴定, 并记录结果。在GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中下载夜蛾科cox1基因序列545条，与71条样本序列进行整合，使用ClustalW 进行比对，剔除错误序列，得到长度为877 bp 的序列616条。用MEGA 6.0 (Tamuraetal., 2013) 计算属内、种内种间遗传距离。筛选出135条同源序列 (包括71条样本序列) 构建系统发育树。

所得的71条28S样本序列进行校对后，在GenBank 中下载夜蛾科28S同源序列4条，与样本序列进行整合，使用ClustalW 进行比对，得到长度为925 bp 的序列75条，构建系统发育树。

对于基于cox1和28S整合形成的数据集，分别用MEGA 6.0 构建 Maximum Parsimony (MP) 树，选择 Kimura-2-Parameter(K2P)模型(Kimura, 1980)构建 Neighbor-joining(NJ) 树，选择Jukes-Cantor 模型 (Jukes and Cantor, 1969) 构建 Maximum Likelihood (ML) 树。

2　结果与分析

2.1取样

本文采集标本71头，均成功获取线粒体cox1及核基因28S。根据形态特征，71头标本均成功鉴定到种，归为14属14种，标本详细情况见表1。

2.2BOLD系统鉴定结果

将71头标本的cox1序列逐一在BOLD系统进行鉴定，BOLD系统鉴定相似度在98.41%-100%，相似度达到100%有35个，全部与形态鉴定结果相同，成功率为100% (表1)。

表1　样本信息

2.3系统发育树鉴定结果

在基于cox1序列所构建的系统发育树中，本文采集的14个种类，除了Eariasclorana没有同种的同源序列以外，其他13个种均有相同种类的同源序列。MP树、NJ树、ML树的结果显示，拓扑结构虽有差异，鉴定结果没有差别。同一种名序列全部聚在一起，而且都为单系，鉴定成功率为100%。与形态鉴定结果完全相符 (图 1 A-C)。

在基于28S序列所构建的系统发育树中，只有两个种有同种的同源序列 GU350477_Helicoverpaarmigera和 HQ178553_Agrotisipsilon。为了提高鉴定的准确性，我们筛选了两个与Agrotisipsilon和Eariasclorana同属的同源序列GQ229492_Eariasvitella, AF178904_Agrotissegetum。MP树、NJ树、ML树的结果表明，拓扑结构虽有差异，鉴定结果没有差别，但鉴定成功率仅为 64.8%。有些同种序列并没有聚在一起，而有些不同种名的序列反而形成单系。20150133_Lacanobiaaliena与其他10个不同种 20150106-20150115 _Anartatrifolii形成单系， HQ178553_Agrotisipsilon没有与同种的其他5个种 20150101-2015105_Agrotisipsilon形成单系，而与同属的 AF178904_Agrotissegetum形成单系。20150137_Maliatthasinifera与两个不同种 20150129-20150130_Emmeliatrabealis形成单系。20150125-20150127_Eariasclorana与另一个种 GQ229492_Eariasvitella形成单系，20150128_Emmeliatrabealis作为系统发育树的树根，没有与三个同名种聚在一起，显出较大的差异。 (图 2A-C)。

2.4种内与种间遗传距离

筛选的616条cox1序列，共17属59种，包含本研究的14种。16个属的属内平均遗传距离为0-9.2%，59个种的种间遗传距离为1.5%-69.9%，平均遗传距离为18.1%。种内遗传距离在0-1.8%，平均种内遗传距离为0.29%，有4个种Abagrotisnefascia,Agrotissp.,Helicoverpapunctigera,Niphonyxsegregata的种内遗传距离在1.0%-1.8%，其余55个种均小于1%。种间遗传距离在1.5%-3.0% 的种类全部集中在Abagrotis属的Abagrotisnefascia，Abagrotisnanalis，Abagrotismirabilis，Abagrotisvittifrons，Abagrotisplacida。

2.5错误序列的鉴定

在种内遗传距离的计算过程中，发现有8个种的种内平均差异很大，最低为3.9%，最高达38.5%。8个种分别为Emmeliatrabealis，Helicoverpaarmigera，Helicoverpaassulta，Helicoverpapunctigera，Helicoverpazea，Macdunnoughiaconfusa，Pyrrhiaumbra，Parabagrotisexsertistigma。8个种的序列中，均有1条以上的序列与其他序列的差异很大，为核实序列的可靠性，本文将所有序列在BOLD系统中进行鉴定，结果发现序列的鉴定结果与标本名称不符。这种错误序列的出现，有可能是测序问题，或是实验污染所致，这种错误会导致鉴定中出现的阳性偏差和阴性偏差，Wiemers等(2007)在对鳞翅目蝶类灰蝶科Lycaenidae的研究中，也发现这一现象。本文在研究过程中，去掉了这些错误序列，以免对研究结果产生影响。

图 1　基于线粒体cox1构建的MP树(A)、NJ树(B)、ML树(C)Fig. 1　MP tree (A), NJ tree (B), ML tree (C) based cox1 gene注：标星序列为本文的样本序列 (下图同)。Note：The star-marked sequences are from this paper(the same below).

图 2　基于核基因28S构建的MP树(A)、NJ树(B)和ML树(C)Fig. 2　MP tree (A), NJ tree (B) and ML tree (C) based 28S gene

3　讨论与结论

3.1BOLD系统

BOLD系统所推荐的物种鉴定标准为大于98%，可视为鉴定成功 (Ratnasingham and Hebert, 2007)。从BOLD系统鉴定结果来看，鉴定成功的序列相似度均在98.41%以上，符合BOLD系统推荐的标准。由于BOLD系统执行较为严格的数据保存方法，包括DNA序列的原始测序数据和实物标本的证据照片，保证了BOLD系统数据的真实性和准确性，错误率远低于GenBank数据库，对于其他数据库有很大的借鉴意义。

3.2系统发育树

基于cox1基因构建的系统发育树，鉴定成率为100%，表明cox1作为夜蛾科种类DNA条形码的通用基因是可行的。MP树、NL树和ML树仅拓扑结构有较小差异，对鉴定结果没有影响。说明在序列可靠的情况下，聚类分析方法的选择并不起决定因素。近年来，有研究人员针对其他类群还提出贝叶斯 (Nielsen and Matz, 2006)、Unweighted pair group method with arithmetic mean(UPGMA) (Lahayeetal., 2008)、特征法(宋韶彬等，2014)等计算方法，相对而言，NJ法、ML法更为常用。基于28S构建的系统发育树，鉴定成功率都比较低，表明28S不适宜于夜蛾科种级分类鉴定，但在一些类群的较高阶元系统发育分析中有所应用 (陈诚等2010；梅洪等，2007)

3.3种间差异阈值

本文的研究发现，种内遗传距离除了4个种在1.0%-1.8%，其他93%的种内遗传距离都低于1.0% (图 3)。种内遗传距离大于1.0%的种类大多分布在不同地区。Abagrotisnefascia采自加拿大英属哥伦比亚省的不同地区，Helicoverpapunctigera采自澳大利亚和加拿大，Niphonyxsegregate采自加拿大与中国北京，而分布范围广泛的物种，如棉铃虫，本文了收集了39条cox1序列，种内差异为0。种内遗传距离较大的现象与物种生殖隔离有关，有助于研究人员对同一物种在不同地域分布演变进行进一步研究。种与种两两之间计算出的种间遗传距离只有10对在1.5%-3.0%，剩余1601对都大于3% (图 4)。说明Abagrotis属的这几个种同源性较高。

图3　基于Kimura-2-Parameter模型的种内遗传距离散点图Fig.3　Intraspecific genetic distances scatter plot based Kimura-2-Parameter model

本文研究发现，种内遗传距离和种间遗传距离虽然有稍许重叠，但3%阈值现象仍比较明显。Hebert等根据鳞翅目研究结果发现种内遗传距离一般都低于1%，种间遗传距离至少为3%，同属种间遗传距离为6.8%(Hebertetal., 2003)，本文研究结果与Hebert相似。也有学者对阈值提出了反对意见，认为阈值的出现是由于人为取样的原因所造成(Wiemers and Fiedler, 2007)，3%的种间差异有可能过大，会导致鉴定错误 (Rudolfetal., 2008)。本文的取样仅限于夜蛾科，其他种类有待进一步研究。

DNA条形码技术一直存在争议，尤其是cox1基因作为通用序列，并不适用于所有种类，有研究人员尝试将ITS2、cox2 等多基因片段用于双翅目、半翅目等类群的DNA条形码鉴定，已取得较好效果 (Bourkeetal., 2012; Chenetal., 2013)。BOLD系统自筹建以来，历经多年的丰富和完善，DNA条形码序列现已超过490多万条，涵盖了动物、植物和真菌等多个门类。为物种鉴定、系统发育学及种群遗传学等相关研究工作提供了有力的支撑。同时也要认识到，DNA条形码虽然有一定的应用前景，但不能取代传统分类方法，有时仍然需要综合形态学、生态学等多种特性来确保物种鉴定的准确性。

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DNA barcoding of moths (Lepidoptera: Noctuidae) in an apple orchard

WU Yu-Peng1, 2，WU Chun-Sheng2，LU Jun-Jiao3，YANG Jing3，ZHU Chao-Dong2*

(1. Taiyuan University of Science and Technology, Taiyuan 030024, China;2. Key Laboratory of Zoological Systematics and Evolution, Institute of Zoology, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China;3. Institute of Plant Protection, Shanxi Academy of Agricultural Sciences，Taiyuan 030031, China)

In order to test the feasibility of DNA barcoding in identification of noctuid moths of Lepidoptera, 71 samples (14 species in total) were collected from an apple orchard of Changping District, Beijing. And the mitochondrial gene ofcox1 and the nuclear gene of 28S were amplified and sequenced. The comprehensive analysis was performed with the methods of phylogenetic trees, genetic distance, and threshold value. Meanwhile, the success rate of BOLD system for identifying species was examined. The results were as follows: With thecox1 gene and the BOLD system, the success rate of identification achieved 100%. However, the fragment of 28S only possessed the success rate of 64.8%. Using different methods of phylogenetic analysis, the topology structures of different phylogeny trees were consistent, as was the case in species identification. The intraspecific distances that below 1% accounted for 93%, and the interspecific distances that more than 3% occupied 94%. The interspecific genetic distances were greater than the intraspecific distances, with the threshold value of 3%.

Orchard; noctuidae; DNA barcoding

山西省自然基金项目(2015011077)；太原科技大学博士科研启动基金(20142031)

武宇鹏，男，1978年生，讲师，研究方向为环境生物学，E-mail: wuyupeng007@163.com

Authors for correspondence，E-mail: zhucd@ioz.ac.cn

2016-04-05；接受日期Accepted：2016-06-30

Q963；S433.4

A

1674-0858(2016)04-0813-08