新疆沙枣多糖的提取分离及抗氧化活性研究

陈晴晴，杨金凤，刘红（．石河子大学化学化工学院，新疆石河子832000；2.石河子大学理学院，新疆石河子832000）

新疆沙枣多糖的提取分离及抗氧化活性研究

陈晴晴1，杨金凤1，刘红2，*
（1．石河子大学化学化工学院，新疆石河子832000；2.石河子大学理学院，新疆石河子832000）

采用水提醇沉法提取新疆沙枣多糖，并采用DM-18型大孔树脂对粗沙枣多糖进行分离纯化，确定了最佳的分离条件。通过粗沙枣多糖和纯化后的沙枣多糖对DPPH自由基、羟基自由基（·OH）、超氧阴离子自由基（O2－·）的清除能力进行比较。结果表明：在沙枣多糖样品溶液2.0 mg/mL，上样速率为1.5 BV/h，上样液pH值为7.0，上样量为3.0 BV、洗脱剂乙醇浓度为35%、洗脱剂用量为3.0 BV、洗脱速率为1.0 BV/h时，洗脱剂pH值为8时，DM-18型大孔树脂对沙枣多糖的动态吸附率和解吸率分别达到90.23%和92.37%，粗沙枣多糖的纯度为42.33%，纯化后的多糖纯度为70.56%。粗多糖和纯化后多糖对DPPH·、·OH、O2－·均有清除作用，纯化后多糖的抗氧化活性大于粗多糖。

沙枣多糖；大孔树脂；分离；纯化；抗氧化

多糖类物质在自然界中广泛分布于动物、植物及微生物中，是一类具有复杂化学结构和特定生物活性的有机大分子化合物[1]。如今多糖类化合物广泛的被应用在医疗、保健等方面，多糖作为中药的主要有效成分，其研究发展速度很快，已有数种多糖被作为广谱免疫促进剂应用于临床治疗中[2-3]。沙枣具有抗旱、抗盐碱的特性，在新疆有丰富的资源，且具有很高的食用与药用价值，沙枣能“强壮，镇静，固精，健胃，止泻，调经，利尿”，因而作为维吾尔族人民在民间长期食用[4]。沙枣中多糖含量在9%～10.9%之间，平均含量9.76%[5-6]。以DM-18型大孔吸附树脂为分离纯化沙枣多糖的材料，确定其最佳吸附及解吸条件，并对粗沙枣多糖和纯化多糖两者的抗氧化活性能力进行比较，为沙枣多糖的进一步开发及应用提供理论参考。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

沙枣：采自石河子地区；DM-18型大孔树脂：山东鲁抗立科药物化学限公司；DPPH：美国Sigma公司生产；邻苯三酚、95%乙醇、水杨酸、浓硫酸、苯酚、硫酸亚铁、铁氰化钾、氢氧化钠、盐酸：均为分析纯；葡萄糖标准品：购自北京中国药品生物制品鉴定所。

层析柱：购自中国科学院昆明植化所；飞鸽牌台式离心机：上海安亭科学仪器厂；BüchiRotavapor旋转蒸发器：瑞士BüchiLabotechnikAG；722G可见分光光度计：上海仪电分析仪器有限公司；BS210电子分析天平：德国Sartorius公司。

1.2方法

1.2.1沙枣多糖含量的测定

沙枣多糖含量采用硫酸－苯酚法，以葡萄糖为对照品，用可见分光光度法在波长490 nm处测定其吸光度，得回归方程A=0.010 1c+0.002 7，R=0.999 1；通过测定样品溶液的吸光度计算溶液中多糖的含量。

1.2.2沙枣多糖的提取

沙枣粉碎后过30目筛，称取1.00 kg，用95%乙醇浸泡24 h除去脂溶性成分，然后过滤，滤渣按质量比1∶14的量加热水，热水浸提2次，90 min/次，温度90℃；抽滤，合并滤液，离心；取上清液旋蒸，浓缩至一定体积后再离心；加入95%的乙醇，冷藏醇沉24 h，依次醇沉2次，过滤得沉淀，至通风处晾干后，将沉淀物加水复溶，用sevage法除蛋白2次～3次，透析48 h，浓缩，冷冻干燥即得沙枣多糖粗品，根据1.2.1方法对粗沙枣多糖的纯度进行测定，结果为42.33%。

1.2.3大孔树脂柱层析分离

沙枣多糖的初级分离采用大孔树脂法，前期试验优选出DM-18型大孔树脂为分离沙枣多糖的分离材料。通过该大孔树脂对多糖的吸附和解吸正交试验，确定出该大孔树脂对沙枣多糖的最佳分离条件，在最佳分离条件下，依次上样吸附和解吸，得到的解吸液旋蒸浓缩，冷冻干燥，既得DM-18型大孔树脂纯化后的沙枣多糖样品，根据1.2.1方法对粗沙枣多糖的纯度进行测定，纯化多糖的纯度为70.56%。

1.2.3.1大孔树脂的吸附试验

在单因素试验的基础上，选取沙枣多糖上样液浓度1.5、2.0、2.5 mg/mL；上样量2.0、3.0、4.0 BV；上样速率1.0、1.5、2.0 BV/h；上样液pH 7.0、8.0、9.0，进行正交试验，以DM-18大孔树脂对沙枣多糖的吸附率为评价指标，设计L9（34）正交试验。

1.2.3.2大孔树脂的解吸试验

第三层，“时为岑寂也，若游峨眉之雪；时为流逝也，若在洞庭之波”。远的第三层次就是一种自然山水之境。而自然山水之境是中国古典艺术意境的最高境界。从庄子的游心于“物之初”到魏晋名士的恣情于丘壑之间，再到宋元文人的水墨山水情趣，自然山水一直是文人墨客笔下的心头爱。而在琴者弹琴中，所要创造的最高意境也就是自然山水之境。

在单因素试验的基础上，选取洗脱剂乙醇浓度选取25%、35%、45%；洗脱剂乙醇用量选取2.0、3.0、4.0 BV；洗脱速率选取1.0、2.0、3.0 BV/h，洗脱剂pH 6.0、7.0、8.0，进行正交试验，以DM-18大孔树脂对沙枣多糖的解吸率为评价指标，设计L9（34）正交试验。

1.2.4沙枣多糖的抗氧化活性试验

由1.2.1得到的沙枣多糖粗品，和经DM-18型大孔树脂分离后的纯化沙枣多糖，配成一定浓度的沙枣多糖溶液，分别进行以下三方面的抗氧化活性试验，并对两者的抗氧化能力进行比较。

1.2.4.1清除DPPH·的能力

分别取未纯化的粗沙枣多糖和用大孔树脂纯化后的多糖进行试验，取不同浓度的样品溶液2.0 mL和0.2 mmol/L DPPH乙醇溶液2.0 mL，加入具塞试管中混匀，室温避光反应30min，在517 nm下测吸光度值Ai[7]，2.0 mL DPPH溶液加2.0 mL蒸馏水的吸光度值为A0，2.0 mL无水乙醇加2.0 mL样品溶液吸光度值为Aj，以等体积的蒸馏水和无水乙醇混合为空白。清除率/%=[A0－（Ai－Aj）]/A0×100。

1.2.4.2清除羟基自由基（·OH）的能力

·OH是最活泼的活性氧自由基，也是危害最大的氧自由基，采用Fenton反应[8]，分别取未纯化的粗沙枣多糖和用大孔树脂纯化后的多糖进行试验，在试管中分别加入1.0 mL各浓度的样品溶液，1.0 mL 6 mmol/L FeSO4，1.0 mL 6 mmol/L水杨酸乙醇溶液，1.0 mL 6 mmol/L H2O2，混匀，在37℃水浴中加热30 min，在波长510 nm下测吸光度值Ai，再将体系中样品溶液用1.0 mL蒸馏水代替，测得吸光度值为A0，将体系中H2O2用蒸馏水代替，测得吸光度值为Aj。清除率/%=[A0－（Ai－Aj）]/A0× 100。

1.2.4.3清除超氧阴离子（O2－·）的能力

2　结果与分析

2.1DM-18型大孔树脂对沙枣多糖动态吸附的正交试验

以大孔树脂对沙枣多糖的吸附率为考察指标，设计L9（34）正交试验，试验结果见表1。

如表1所示，DM-18型大孔树脂对沙枣多糖的最佳吸附条件为A2B2C1D2，即上样浓度为2.0 mg/mL，上样速率为1.5 BV/h，上样液pH值为7.0，上样量为

表1　正交试验设计及结果分析Table 1　The orthogonalexperimentaldesign and the analysis of the result

3.0BV。极差分析结果表明，对树脂吸附效果影响程度大小依次为：B＞A＞C>D。在最佳试验条件下进行验证试验，平行3组试验，平均吸附率为90.23%，大于正交组任一组数据，正交试验数据真实可行。

2.2DM-18型大孔树脂对沙枣多糖解吸的正交试验在单因素试验结果的基础上，以大孔树脂对沙枣多糖的解吸率为考察指标，设计L9（33）正交试验，试验结果见表2。

表2　正交试验设计及结果分析Table 2　The orthogonalexperimentaldesign and the analysis of the result

从表2可知，DM-18型大孔树脂对沙枣多糖的最佳解吸条件为A2B1C3D2，即洗脱剂乙醇浓度为35%、洗脱速率为1.0 BV/h、洗脱剂pH值为8，洗脱剂用量为3.0 BV。极差分析结果表明，对树脂解吸效果影响程度大小依次为：A＞D＞B＞C。在最佳试验条件下进行验证试验，平行3组试验，平均解吸率为92.37%，大于正交组任一组数据，正交试验数据真实可行。

2.3沙枣多糖的抗氧化活性分析

2.3.1清除DPPH·的能力分析

以粗沙枣多糖和纯化后的沙枣多糖对DPPH·的清除能力比较，设计对比试验，试验结果见表3。

表3　沙枣多糖清除DPPH·能力比较Table 3　Effectof Elaeagnus polysaccharides on DPPH·

由表3可知，随着质量浓度的增大，沙枣多糖对DPPH·的清除能力增加，纯化多糖对DPPH·的清除率明显比粗多糖的高，说明纯化多糖能更有效的清除DPPH·。

2.3.2清除羟基自由基（·OH）的能力分析

以粗沙枣多糖和纯化后的沙枣多糖对·OH的清除能力比较，设计对比试验，试验结果见表4。

表4　沙枣多糖清除羟基自由基（·OH）的能力比较Table 4　Effect of Elaeagnus polysaccharides on·OH

·OH是最活泼的活性氧自由基，也是危害最大的氧自由基，它几乎能与活细胞中任何分子发生反应，且反应速度极快。由表4可知，随着多糖浓度的增加，对·OH的清除作用明显增加，其中多糖的活性顺序为纯化多糖＞粗多糖。结果表明，纯化多糖能更有效的清除·OH。

2.3.3清除超氧阴离子（O2－·）的能力分析

以粗沙枣分糖和纯化后的沙枣多糖对O2-·的清除率能力比较，设计对比试验，试验结果见表5。

表5　沙枣多糖清除超氧阴离子（O2－·）的能力比较Table 5　Effectof Elaeagnus polysaccharides on O2－·

由表5可知，随着多糖浓度的不断增大，沙枣多糖对O2－·的清除能力增大，其中多糖的活性顺序为纯化多糖＞粗多糖。当多糖浓度小于1.0 mg/mL时，两种多糖对O2－·的清除能力相差不大，之后差异性增大，结果表明，纯化多糖能更有效的清除O2－·。

3　结论

采用水提醇沉法，从新疆沙枣中提取多糖类物质，得到纯度为42.33%的沙枣多糖粗品，通过DM-18型大孔树脂对沙枣多糖进行分离纯化，由动态吸附及解吸试验可知，通过正交试验得到最佳的吸附及解吸条件，在最佳条件下，DM-18型大孔树脂对沙枣多糖的吸附率达90.23%，解吸率达92.37%，并在该最佳条件下，得到DM-18型大孔树脂纯化后的沙枣多糖，其纯度为70.56%，通过大孔树脂的的分离纯化，沙枣多糖的纯度明显提高。

沙枣粗多糖和经DM-18型大孔树脂纯化后的多糖对DPPH·、·OH、O2－·均有清除作用，且随着多糖浓度的增大，对自由基的清除作用增加，而经DM-18型大孔树脂纯化后的多糖比粗多糖有更明显的清除效果，纯化沙枣多糖抗氧化活性明显优于粗多糖，沙枣多糖对3种自由基的清除能力由强到弱总体趋势是：DPPH·＞O2－·＞·OH。

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Purification and Antioxidant Activity of Polysaccharide from Elaeagnus angustifolia in Xinjiang

CHEN Qing-qing1，YANG Jin-feng1，LIU Hong2，*
（1.College ofChemistry and Chemical Engineering，Shihezi University，Shihezi832000，Xinjiang，China；2.College of Science，Shihezi University，Shihezi832000，Xinjiang，China）

Polysaccharide from Elaeagnus angustifolia in Xinjiang was extracted by water-alcohol precipitation. DM-18 macroporous resins were used to isolate the crude polysaccharide，the best condition was confirmed. Antioxidant activities of the crude and purified polysaccha ride were evaluated through their capability of scavenging DPPH·，·OH，O2－·.The result showed that best conditions as follows：2.0 mg/mL of concentration and 7.0 of pH of the solution of Elaeagnus angustifolia polysaccharide，the sample loading amount of 3.0 BV，1.5 BV/h ofthe rate，the eluent concentration of35%，the total quantity of eluentof 3.0 BV，8 ofpH ofthe solution and eluent rate of 1.0 BV/h.The rates of absorption and desorption could achieve 90.23% and 92.37% under the conditions above.The purity of the crude polys accharide and the purified polysac charide were 42.33%and 70.56%.Both ofthe polysaccharide crude and purified had significanteffecton scavenging DPPH·，·OH，O2－·. Further more purified polysac charide had more activity antioxidant than crude polysac charide.

Elaeagnus angustifolia polysac charide；macroporous resins；separate；purificate；antioxidation

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.12.009

教育部国际合作项目“春晖计划”（Z2006－1－83003）

陈晴晴（1987—），女（汉），硕士研究生，研究方向：天然产物的研究与开发。

刘红，女（汉），教授，硕士生导师,研究方向：天然产物化学。

2013-09-28