葛根超微粉总黄酮的双频超声辅助提取与纯化

杨丽维，陈颖，张峻（天津市林业果树研究所，天津300384）

葛根超微粉总黄酮的双频超声辅助提取与纯化

杨丽维，陈颖，张峻
（天津市林业果树研究所，天津300384）

以葛根超微粉为原料，采用双频超声强化法进行葛根黄酮的提取，利用大孔树脂吸附法进行纯化，并采用HPLC法进行葛根素的含量测定。结果表明，双频超声辅助提取中总黄酮含量为275.16 mg/g，明显高于单频超声辅助提取的190.8 mg/g，说明双频超声技术与超微粉碎技术相结合可以促进有效成分的提取。葛根素含量由纯化前的11.15%提高到82.47%，纯化效果较好。

葛根；超微粉；黄酮；双频超声辅助提取；纯化

葛根为豆科植物野葛和粉葛的干燥块根。葛根除了含有很高的淀粉成分外，还含有黄酮类物质和异黄酮类化合物，其中主要有效成分为葛根素，具有提高免疫、增强心肌收缩力、保护心肌细胞、降低血压、抗血小板聚集等作用。

近年来，人们用超声波辅助提取葛根中的有效成分颇有成效，但是其声场不够均匀，较易产生驻波，从而影响提取效果[1]。双频超声强化提取法是一种颇具发展潜力的新的萃取技术，可将葛根中的有效成分快速高效地提取出来[2]。另外除了提取方式，葛根前处理也是影响有效成分提取的关键因素。超微粉碎可使葛根细胞壁破碎，促使细胞间和细胞内有效成分直接释放出来，提高葛根中有效成分的溶出速度和溶出率。本试验采用双频超声辅助提取法对葛根超微粉进行提取，利用大孔树脂吸附法对提取液进行纯化，同时采用高效液相色谱法对葛根超微粉进行定量测定和有效成分质量检测的研究。试验将双频超声技术与超微粉碎技术相结合，突破了传统的萃取方法，旨在为葛根生产加工实践提供理论参考。

1　材料与仪器

葛根：产自云南；葛根素标准品：中国药品生物制品检定所；无水乙醇：天津市恒昊公司化学试剂厂；大孔吸附树脂NKA-2：南开大学化工厂。

YM-40C研磨式超微粉碎机：青州市迈德森制药机械厂；BILON-2009型智能温控双频超声波萃取仪：上海比朗仪器制造有限公司；Thermo Fisher R404A离心机：赛默飞世尔科技公司；DHG-9070A型电热恒温鼓风干燥箱：上海一恒科技有限公司；TU-1901双光束紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限公司；Agilent1100型高效液相色谱仪：美国安捷伦公司。

2　方法

2.1样品处理

将葛根洗净、晾干、切片、烘干，用粉碎机将葛根片粉碎后过80目筛得葛根粗粉。将葛根粗粉经过超微粉碎后过300目筛得到的细粉即为葛根超微粉[3]。

2.2葛根总黄酮的提取及含量测定

采用25/35 kHz、电功率200 W的双频超声和25 k Hz、电功率200 W的单频超声分别对葛根超微粉进行处理，以40%乙醇为提取剂，葛根超微粉的投料量为5 g，固液比1∶20（g/mL），超声温度50℃，超声时间30 min，提取后离心取上清液，剩余滤渣继续超声提取，分别提取4次，所得提取液在紫外分光光度计上250 nm波长处测吸光度值，并计算葛根黄酮含量。

式中：X为浓度，mg/mL；V为提取液体积，mL；W为样品重量，g。

2.3葛根黄酮的纯化

2.3.1大孔树脂的纯化

样品提取液的浓度为13 mg/mL，按1 mL/min的流速通过NKA-2大孔吸附树脂，同时检测收集液，直至吸附饱和出现泄漏点，停止上样，再用2 BV蒸馏水洗脱，然后用5 BV20%乙醇溶液，3 BV/h洗脱[4]，每5 mL收集一管流出液，备用检测。

2.3.2样品固形物含量的测定

精密量取纯化前后的样品液各5 mL，置于干燥恒重的蒸发皿中，70℃烘箱中蒸干至恒重，取出立即放入干燥器中，待至常温后迅速称量[5]。

式中：W1为培养皿烘干后恒重，mg；W2为培养皿+样品液烘干后的恒重，mg；V1为样品液体积，mL。

2.3.3葛根素的含量测定

色谱条件：AgilentC18柱，柱温25℃，波长250 nm，流动相：甲醇-0.1%磷酸（25∶75）（体积比），流速0.8 mL/min，进样量5μL，进样时间30 min/个。

葛根素标准品的配制：精密称取葛根素5 mg，加30%乙醇5mL，充分溶解得到1 mg/mL葛根素标准品溶液。

将葛根素标准品溶液和样品溶液分别通过0.45μm滤膜过滤至1.5 mL样品瓶中，进行HPLC检测，通过峰面积测定葛根素含量。

3　结果与分析

3.1葛根素标准曲线的制作

用30%乙醇配制浓度为1 mg/mL标准品溶液，再用95%乙醇将其稀释至浓度为0.1 mg/mL，从中精密吸取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL，分别置于小试管中，并各加95%乙醇补充至1 mL，再分别加蒸馏水4 mL稀释，摇匀。同时精密吸取95%乙醇1 mL，置小试管中，加水4 mL摇匀，作为空白对照溶液。250 nm波长处测吸光度值，绘制标准曲线图，见图1。

图1　葛根素标准曲线Fig.1　Standard curve of puerarin

3.2双频超声和单频超声辅助提取对葛根总黄酮含量的影响

双频超声和单频超声辅助提取对葛根总黄酮含量的影响见图2。

图2　双频超声和单频超声辅助提取对葛根超微粉中总黄酮含量的影响Fig.2　The influence of dual-frequency ultrasonic-assisted and single frequency ultrasonic-assisted extraction on the flavonoidscontent of the Pueraria submicron powder

由图2可以看出，在双频超声和单频超声处理下，葛根超微粉的4次提取过程中，第1次的黄酮提取效率均在80%以上。将4次提取的量相加得出，双频超声提取中总黄酮含量为275.16 mg/g，明显高于单频超声提取的190.8 mg/g，这说明双频超声可以增大振幅，扩大传质面积，使声场比较均匀，产生比单频超声更强烈的空化效应[1]。超微粉碎可以将葛根细胞壁破碎，细胞中的有效成分溶出快而且溶出率高，相应提取的总黄酮含量就高。可见，将双频超声技术与超微粉碎技术相结合可以促进葛根有效成分的提取，更好地使

其功能成分得到有效利用。

3.3葛根素标准品和葛根样品的HPLC图谱

葛根素标准品和葛根样品的HPLC图谱见图3、图4、图5。

图3　葛根素标准品液相色谱图Fig.3　HPLC figure ofpuerarin standard substance

图4　纯化前样品中葛根素液相色谱图Fig.4　HPLC figure ofpuerarin in the sample before purification

图5　纯化后样品中葛根素液相色谱图Fig.5　HPLC figure of puerarin in the sample after purification

对葛根素标准品溶液和纯化前后的样品溶液进行HPLC检测。从图3可以看出，在250 nm处，葛根素标准品出峰时间为11.224 min，而且峰型陡峭、对称，没有杂峰。图4和图5在11.157 min和11.209 min均出现一个明显的最大吸收峰，与标准品的出峰时间基本吻合，可以推断出该峰为葛根素峰。从样品溶液的HPLC图谱来看，除了葛根素这个主峰之外，其余杂峰都非常小，这说明葛根素在葛根总黄酮中占有很大成分[6]。

3.4纯化前后超微粉中葛根素含量的测定

以NKA-2树脂为吸附剂，20%乙醇溶液为洗脱剂，以1 mL/min的流速进样，对葛根超微粉提取液进行纯化。纯化前后葛根超微粉中葛根素含量的比较见表1。

表1　纯化前后葛根超微粉中葛根素含量的比较Table 1　The comparison of the puerarin contentin the Pueraria submicron powder before and after purification

由表1可以看出，样品中葛根素含量由纯化前的11.15%提高到82.47%。可见，大孔树脂吸附法对葛根黄酮的纯化是可行有效的[7]，也是提取高纯度葛根黄酮有效成分的较好的方法。

4　讨论

1）本试验采用双频超声技术与超微粉碎技术相结合的方法进行葛根黄酮的提取，突破了传统的萃取方法，大大提高了葛根黄酮含量。与单频超声相比，双频超声会产生更强烈的空化效应，提取效果更显著。超微粉碎技术能够提高植物细胞破壁率，显著提高有效成分的释放速度和释放量，从而提高生物利用度[8]。

2）大孔树脂吸附法是一种简单、安全、快速的分离纯化方法[9]，避免了用有机溶剂纯化而造成的成本高、回收难、损耗大、对环境污染等缺点。本研究采用的NKA-2型大孔树脂对葛根黄酮具有良好的分离纯化效果，其中葛根素含量由纯化前的11.15%提高到82.47%。

3）试验采用HPLC法测定葛根中葛根素的含量，具有样品用量小、分离效果好、操作简便、准确可靠等优点，可为葛根超微粉质量控制和后续开发提供精确的检测方法[10]。

[1]张晓燕,丘泰球,徐彦渊,等.双频超声强化提取葛根有效部位的研究[J].食品工业科技,2006,27(3):51-54

[2] 贲永光,丘泰球.双频超声对海金沙中黄酮提取率影响的研究[J].食品与生物技术学报,2006,25(4):51-55

[3]张加梅,陈光芝,褚新红.超微粉碎对提取葛根药材中总黄酮、多糖的影响[J].中国药业,2008,17(10):45-46

[4]李适,岳明珠,李银花,等.正交试验优化葛根素的大孔树脂纯化工艺[J].食品科学,2013,34(16):89-92

[5]杨欣欣,雷雪霏,曹爱民,等.葛根超微粉仿生提取条件的研究[J].辽宁化工,2008,37(3):148-149

[6]董华强,刘福来,林丽超,等.合水粉葛异黄酮含量的紫外分光光度法和HPLC法分析研究[J].食品科学,2008,29(10):477-479

[7]刘杏荣.葛根异黄酮的检测方法与提取纯化工艺研究[D].镇江:江苏大学,2007:57

[8]任少伟,张文成,李兵,等.HPLC法测定葛根超细粉中葛根素含量[J].包装与食品机械,2014,32(3):67-69

[9]肖卫民.葛根总黄酮的微波辅助萃取与大孔树脂纯化[D].重庆:西南农业大学,2004:29

[10]夏虹,彭茂民,周有祥.葛根超微粉、葛粉中葛根素、大豆甙和大豆甙元的分析研究[J].应用化工,2010,39(10):1601-1603

Dual-frequency Ultrasonic-assisted Extraction and Purification on Flavonoids of Pueraria Submicron Powder

YANG Li-wei，CHEN Ying，ZHANG Jun
（Tianjin Research Institution of Forestry and Pomology，Tianjin 300384，China）

Pueraria submicron powder was used as raw material.Pueraria flavonoids was extracted by dual-frequency ultrasonic strengthening methods，purified by macroporous resin adsorption method.And the content of puerarin was determined by the HPLC method.The results showed that，the flavonoids contentofdual-frequency ultrasonic-assisted extraction was 275.16 mg/g，significantly higher than 190.8 mg/g of single frequency ultra－sonic-assisted extraction，that was dual-frequency ultrasonic-assisted technology and the superfine grinding technology could promote the combination ofthe extraction ofeffective components.The content of puerarin increased from 11.15%to 82.47%by purification which was good purification effect.

Pueraria；submicron powder；flavonoids；dual-frequency ultrasonic-assisted extraction；purification

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.12.015

杨丽维（1981—），女（汉），助理研究员，硕士，主要从事农产品加工方面的研究工作。

2016-03-21