进水碳氮比对脱氮污泥羟胺氧化酶活性及N2O产生的影响

魏旖旎,何志仙,袁林江



进水碳氮比对脱氮污泥羟胺氧化酶活性及N2O产生的影响

魏旖旎,何志仙,袁林江*

(西安建筑科技大学环境与市政工程学院,陕西 西安 710055 )

在以A/O方式运行的SBR工艺中,研究了3种不同进水碳氮比下硝化与反硝化过程中污泥羟胺氧化酶(HAO)活性变化、N2O的产生/释放规律及两者之间的关联性.结果表明,当C/N=3.5与C/N=9.5时,HAO平均酶活性分别为(283.77±19.64),(348.87±17.94)U/g MLSS,而C/N=6.5条件下的平均酶活性仅为(246.45±23.30)U/g MLSS,总体上3个条件下缺氧阶段HAO活性均较好氧阶段高;反应过程中HAO的活性变化趋势基本与气态N2O释放速率、溶解态N2O及亚硝氮的浓度变化趋势成正相关,在C/N=9.5下好氧段HAO活性与后三者呈现完全一致的变化规律. N2O主要产生于好氧阶段进行的硝化过程,尤其是羟胺氧化是N2O产生的主要环节;碳源相对不充分的条件下(如C/N=3.5),缺氧段N2O的释放与HAO活性关系密切;碳源相对较充分的条件下,缺氧段N2O的产生与HAO酶活性无明显关联.推测可能是因为缺乏电子受体NO2-而导致HAO酶未参与反应;在N2O产生较多的条件下,HAO活性相对也较高.

碳氮比；羟胺氧化酶；N2O；SBR；硝化；反硝化

近20年来,全球对温室效应的关注不断加大,对温室气体的减排的呼声日益高涨.尽管大气中N2O含量极微,但其温室效应能力是CO2的320倍.因此对N2O排放的削减尤为重要.N2O的人为源和天然源分别占我国N2O释放量的71%和29%[1],污水的脱氮过程是N2O的一个不可忽视的产生源.近几十年来,随着城市污水生物脱氮的普遍应用,处理过程中也会释放大量的N2O,日益成为重要的N2O排放源[2-3].

进水碳氮比对生物脱氮有着很大的影响.一方面进水碳氮比直接影响系统反硝化的程度,由于反硝化过程需要有机碳源提供电子受体,反硝

化过程中低碳氮比可能会增加N2O释放[4-6],因此碳氮比可对控制N2O产生起关键作用[7-8].另一方面,在限制性供氧条件下,由于有机碳氧化和硝化竞争氧,碳氮比对硝化也有影响.进水碳氮比对参与硝化和反硝化作用的酶活性均有影响[9].污水生物处理过程中,酶是控制N2O释放的关键所在[10].自养硝化过程中N2O通过AOB硝化菌反硝化或羟胺氧化(化学和生物)产生,其N2O的产生涉及多种酶参与[11].羟氨氧化还原酶(HAO)是在硝化阶段将羟胺转化成亚硝酸盐的氧化还原酶,位于细胞膜外周质中.羟胺在好氧和厌氧条件下均能被HAO氧化[12],而N2O是羟胺氧化的副产物[13].HAO可能在N2O的产生中起着重要作用.但是,有关污水处理中不同工艺条件下的酶学研究报道甚少.

本研究采用模拟废水,在以A/O方式运行的实验规模的SBR中,对生物脱氮过程中N2O产生进行了测定,研究了与N2O产生有关的HAO酶活性变化,探索了进水碳氮比对生物脱氮过程中N2O的释放量与羟胺氧化酶活性之间的关系,旨在揭示污水生物脱氮过程中N2O释放与酶的关系,为控制N2O产生提供参考.

1 材料与方法

1.1 试验用水水质

表1 人工废水配方Table 1 Composition of synthesized wastewater

注:*微量元素组分(g/L): 0.15H3BO3; 0.03CuSO4×5H2O; 0.18KI; 0.12MnSO4×H2O; 0.06Na2MoO4×2H2O; 0.12ZnSO4×7H2O; 0.15CoCl2×6H2O; 10 EDTA-2Na配制而成.

试验采用人工模拟废水,其组分为葡萄糖、乙酸钠、氯化铵、磷酸二氢钾、硫酸镁、氯化钙、硫酸亚铁和微量元素,微量元素由FeCl3·6H2O、H3BO3、CuSO4·5H2O、KI、EDTA、MnCl2·4H2O、ZnSO4·7H2O和CoCl2·6H2O组成,投加碳酸氢钠用以提供硝化阶段所需碱度.以乙酸钠和葡萄糖以1:1比例作为混合碳源.氯化铵作为氮源,氨氮60mg/L下、不同进水碳氮比(3.5,6.5,9.5)下的3个A/O-SBR反应器同时运行.通过控制COD设置不同碳氮比,为了保证不同碳氮比之间结果的可比性,反应器污泥浓度控制在(3485.67± 115)mg/L.试验用废水配方见表1,不同碳氮比下碳源配方见表2.

表2 不同碳氮比条件下的碳源配方(mg/L)Table 2 Composition of carbon resource of the wastewater with different carbon to nitrogen ratio(mg/L)

1.2 试验接种污泥与反应器

试验接种污泥来自西安市第四污水处理厂的A2/O工艺二沉池回流混合污泥,接种前先将污泥闷曝24h,之后投入反应器中,进行活性污泥的培养与驯化.

培养驯化采用上述模拟废水在SBR反应器中进行.装置如图1所示.每天运行3个周期,每个周期为8h,包括进水10min,缺氧搅拌120min,好氧曝气240min,沉淀40min,出水10min,闲置60min.反应器为全密封有机玻璃柱制成,高60cm,外径25cm,有效容积为6L,混合液总容积5L,反应器排水比为0.5,反应器的进出水曝气搅拌由液位继电器、蠕动泵、电磁阀和时控开关共同控制;反应器通过气体流量计控制曝气过程中气体流量,反应器底部设有磁力搅拌器用来维持体系的均匀;在反应器外部设有保温层,控制温度在(25±3)℃.pH值控制在6.5~7.5,MLSS维持在3000~4000mg/L下,分别进行3种不同碳氮比梯度下的污泥驯化和相应的试验.运行过程中,曝气量始终维持在1.0L/min.

1.3 分析方法

1.3.1 分析项目及测定方法 在一个周期中,进水混匀后立即取水样作为0时刻的样品,以后每隔0.5h取一次水样.水样经定性滤纸过滤后,取滤液分析NH4+-N、NO3--N、NO2--N、COD与TN等指标.pH值和DO在运行过程中定时监测.pH值采用梅特勒-托利多(上海)有限公司FE-20型酸度计测定;DO、ORP采用溶氧仪(HQ40d,美国)每隔5min测定一次;COD采用的快速消解法进行测定;NH4+-N采用纳氏试剂分光光度法; NO3--N采用紫外分光光度法测定;NO2--N采用N-(1-萘基)-乙二胺分光光度法;TN采用碱性过硫酸钾消解紫外分光光度法;MLSS采用滤纸称重法.测定方法均参照水和废水监测分析方法进行[14].

1.3.2 N2O气体的采集与测定 在整体密闭的SBR反应器的出气口处,用25mL注射器采集密闭反应器上部空间的气体至50mL气体采样袋中.间隔30min采集一次样品,在24h内进行测定.N2O采用配备有63Ni电子捕获检测器(ECD)的与Porapak Q填充柱的Clarus PE-600气相色谱仪分析气样,每次进样1mL.色谱的运行条件为:ECD检测器温度380℃,柱温50℃,进样口温度150℃,载气为高纯氮气,流速为30mL/min.取3次重复的平均值.溶解性N2O用顶空法[15]并稍作修改后收集气体,测定上部气体中的N2O浓度,测定方法同气态N2O.

1.3.3 羟胺氧化酶的提取与测定 粗酶的提取:参照Otte等[16]的提取方法,通过不同细胞破碎方法等提取方法的优化,具体的提取步骤如下:取泥水的混合液25mL,在4000r/min下离心4min,倾去离心后上清液,沉淀用缓冲液(50mmol/L Tris-HCl,5mmol/L MgCl2,pH 7.8)定容到25mL,再次在4000r/min下离心4min,倾去上清液,此步骤重复一次.沉淀中加入5mL细胞裂解液,以缓冲液定容至25mL.在4℃的条件下,用JN-02低温超高压连续细胞破碎仪(广州聚能生物科技有限公司)在1.1×108Pa(1100bar)压力下破碎2次后,在4000r/min下离心20min后倾去粗沉淀,上清液于21000r/min下离心1h,取上清液作为酶提取液.以上步骤均在4℃条件下进行.

酶活力的测定原理:根据HAO酶的氧化特性,实验以铁氰化钾作为电子受体,以羟胺作为电子供体. 在紫外分光光度计400nm处测定吸光值以确定HAO酶的活性,以铁氰化钾的还原量来计算酶活性[11].

酶活性单位定义:25℃时,pH值为8.0条件下每分钟还原1µmol K3Fe(CN)6的酶量为一个酶单位.按下式计算HAO酶的活性(U/mL),摩尔吸光系数为1L/(mol×cm).为光路长度(实验中采用1cm光程比色皿).

酶活性=A400/[××时间]×测定液体积/酶液

体积×稀释倍数

酶活力测定方法:取4mL反应液于比色管中,加入0.5mL酶提取液,立即混匀并计时,在25℃恒温水浴锅中放置反应10min;反应完成后立即加入2mL 2mol/L的盐酸溶液作为终止剂终止酶反应.室温放置10min后,于400nm处测定吸光度;对照实验中先加入2mL 2mol/L反应终止剂,再加酶液.每组试验同时进行3次,取平均值.

2 结果与讨论

2.1 不同进水碳氮比下DO与COD的变化

由图2可见,进水结束后,系统中DO浓度在整个缺氧段基本维持为零,为反应器提供了一个理想的缺氧环境.好氧阶段曝气开始,DO浓度有所上升,维持在一个相对稳定的浓度“平底”.当进水C/N=3.5的条件下,曝气DO浓度迅速上升,曝气60min后,DO达到平台维持1h,之后DO再次上升,270min后达到“饱和”,这一平台为供氧速率和硝化耗氧速率之间提供了平衡,DO维持在5.04~5.98mg/L.当进水C/N=6.5,9.5下, DO浓度基本维持在0.1~0.9mg/L,为供氧速率、硝化耗氧速率和有机物耗氧速率之间提供了平衡;分别在280,260min后,DO再次上升. C/N=6.5下,310min后基本维持在4.97~5.91mg/L,C/N=9.5下, 275min后基本维持在5.25~6.54mg/L.

由图2可见,在3种不同的进水C/N比条件下,COD的去除率分别为89.79%、99.28%、99.99%,无论进水碳氮比的大小,在反应器运行到120min内,COD基本可以得到有效去除.当C/N=3.5时,COD的去除率相比较C/N =6.5与C/N=9.5去除率较低.DO在3种碳氮比下的变化规律基本相同,在好氧段大致可以分为3个阶段,在曝气初期的小幅度升高,曝气中期的逐渐平稳,曝气后期的突然升高.因为本试验采用的供氧模式为限制性曝气,即在一个周期内维持一个固定的氧供给速率,那么在曝气初期DO有一个极小幅度的升高,这是由于在曝气刚开始阶段,供氧速率是大于好氧速率;到了曝气中期,氧供给速率小于微生物基质的利用速率,DO维持在一个较低较平稳的状态,而这时氧的利用率及传递速率则比较高;到了曝气阶段的后期,由于COD不再被微生物利用,导致微生物的好氧速率迅速降低,氧的供给速率远远大于微生物的消耗速率,使DO维持在一个较高的水平,之后的继续曝气则使微生物进入了內源呼吸[17-18].

2.2 不同进水碳氮比下氮素去除效果及PHA的储存及利用

由图3可见,在进水C/N=3.5、6.5、9.5的条件下,系统稳定运行30d后氨氮的去除率分别为78.41%、98.03%和100%,对总氮的去除率分别为59.3%、73.81%、58.01%.缺氧阶段总氮浓度下降是反硝化的作用,进水后硝态氮和亚硝态氮浓度迅速增加,是由于上一周期末硝化反应进行得不彻底,导致反应器中有部分硝态氮和亚硝态氮的残留.当进水C/N=3.5和C/N=6.5时,在整个缺氧段硝态氮与亚硝态氮有部分积累,其原因可能是一些酶对碳源形成竞争,导致反硝化作用受到抑制,低碳氮比下由于碳源不足,微生物生长缓慢,因此脱氮效率下降.总氮的去除率当在C/N =6.5条件下时较其他2个条件要高出近14%~15%.缺氧阶段总氮浓度下降是反硝化的作用.

结合表3可知,C/N越大,PHB的储存量越大.当C/N=3.5和C/N=6.5时,PHAs在好氧段前30min左右就被消耗.但当C/N=9.5时,PHA消耗值仅为2.2mmolC/L,此时异养菌较活跃.厌氧末期PHA储存量最多,为24.2mmolC/L,此时,主要储存为PHB,PHV生成的量较少,PHB占合成PHA的76%以上,但是对于C/N=3.5和C/N=6.5来说,PHV的储存量还是最大的,这可能是由于异养菌首先利用外碳源以及溶解氧进行同化作用[19],因此好氧末还有较多的PHA存留.当C/N=6.5时,随着碳氮比的减小, PHA储存量逐渐下降,PHV占PHA的比例随之增大,当C/N=3.5时,PHA在厌氧末期为4.3mmolC/L,其中PHB与PHV各占PHA的一半;但在好氧末期,PHB为0.5mmolC/L,PHV仅为0.2mmolC/L.说明C/N= 3.5时, PHB和PHV都可以作为内碳源被充分利用[19].

2.3 不同进水碳氮比下N2O释放、溶解性N2O浓度、NO2-N与HAO活性

在3种不同进水碳氮比下,由图4可见,缺氧阶段N2O释放量分别为1.41,0.23,3.40mg,好氧阶段N2O释放量分别为0.56,0.66,2.55mg;缺氧段溶解性N2O释放量分别为18.51,6.95,3.39μg/L,好氧段分别为56.30,30.48,50.11μg/L,从释放量来看是缺氧段N2O较多,这一较高的释放量主要是由于缺氧搅拌开始时第一个采样点的高N2O释放量所导致,该采样点N2O浓度较高,有可能是前2个周期的积累所致.溶解性N2O则是好氧段多,约为缺氧段的3~15倍,同样的环境条件下,产生的气态N2O与溶解性N2O释放量呈正相关,所以N2O主要产生于好氧段,这一结果与Hu等[20-22]一致.

进水碳氮比对缺氧段和好氧段的N2O的释放均有影响,C/N比由3.5增加到6.5时,缺氧段与好氧段产生的N2O均减少, N2O减少86.79%,而C/N增加到9.5时,N2O急剧增大,是C/N=3.5条件下的2.6倍,6.5条件下的7.33倍.Zhen等[20]研究表明当进水C/N比从7.5增加到14.5,N2O转化率从6.0%降低到1.3%.这与Zhen等的研究结果不同,可能是该C/N比条件下羟胺氧化产生更多的是N2O.

由图4可知,缺氧阶段HAO活性较好氧阶段高,HAO活性变化规律基本与气态N2O释放速率、溶解态N2O及亚硝氮的浓度的变化规律基本同步,其在好氧段的最大值与后面三者或一致或提前.在C/N为9.5时好氧段与后三者呈现完全一致的变化规律.

表3 不同碳氮比条件下PHA构成和含量变化Table 3 The composition and content of PHA at different influent carbon to nitrogen ratio

在低碳氮比(3.5)下,由图4a和图5a可知,缺氧段HAO活性、气态N2O释放速率、溶解态N2O变化与亚硝氮的浓度在反应开始后迅速降低,反应1h后回升.由于碳源不足,上个周期硝化反应进行不彻底,出水后残余液中含氨氮,以及氨氮氧化的中间产物NH2OH,在反硝化开始时NO2-在HAO作用下与NH2OH反应生成N2O.随后缺氧环境使得反硝化顺利进行,NO2-被还原,反硝化阶段产生的N2O量降低.因此,HAO活性、气态N2O释放速率、溶解态N2O变化与亚硝氮的浓度呈现一致的变化关系.

NH4+-N在氨单加氧酶(AMO)的催化下生成的NH2OH,在HAO的催化下进一步氧化成NO2-,而不是氧化为N2O,因此在曝气开始后半小时,几乎不产生N2O,曝气和搅拌作用释放出的N2O量减少(图5a中好氧阶段).180min后,N2O产生出现不断增加的趋势.结合图1中的DO浓度变化可知,该C/N比下,DO在150min时已达到1.5mg/L,该条件下,DO充足,氨氮去除率仅(78.72±1.22)%,碳源不足影响硝化细菌的增殖,进而影响有机物和氮的转化.在中碳氮比(6.5)下(图5b),缺氧阶段,由于碳源充足,上个周期硝化反应进行较彻底,出水后残余液中的硝氮NO3-在反硝化开始后被硝酸盐还原酶催化还原为NO2-,并在亚硝酸盐还原酶、NO还原酶作用下生成N2O,最终还原为N2.充足的碳源及缺氧环境使得反硝化顺利进行,反硝化阶段产生的N2O量较低.HAO则随着NO2-的回升有所增大,但HAO活性明显小于C/N比9.5及3.5条件.

在高碳氮比(9.5)下(图5c),充足的碳源及缺氧环境使得反硝化顺利进行,反硝化阶段产生的N2O量降低.这个过程溶解性N2O变化不大,而气态N2O释放速率逐渐降低,HAO酶活性变化范围不大.反硝化阶段释放的N2O,应该是参与反硝化的氧化亚氮还原酶(Nos)活性降低使得的N2O未能及时还原为N2,导致N2O的累积.

图5c中好氧阶段,120~240min期间NO2-浓度变化不大,溶解性N2O和气态N2O释放速率逐渐增大,240min后,N2O释放速率减慢,到270min达峰值后溶解性N2O和N2O释放速率急剧减少.结合图2b,曝气2h,DO为0.1~0.47mg/L,硝化和好氧反硝化同时进行,这一DO浓度更利于好氧反硝化进行,再加上缺氧段剩余的充足碳源使得好氧反硝化迅速进行,因氧化亚氮还原酶竞争电子的能力较弱,到260min时DO达到1.25mg/L,之后迅速增加,270min时达到4.33mg/L,使得硝化反应迅速进行,因此270min出现N2O的最大值.

2.4 讨论

Hu等[23]的研究表明,进水C/N比从7.5增加到14.5, N2O转化率从6.0%降低到1.3%,是硝化单胞菌的减少所致.从本研究结果来看,可能是与HAO酶的活性有关.本研究中,C/N从6.5增加到9.5,N2O转化率从1.42%增加到9.67%,HAO活性在9.5条件下比6.5条件下还高,可能是污泥经过驯化后,氨氧化菌有更高的HAO活性,羟胺在好氧和厌氧条件下均能被HAO氧化[24],从该条件下NO2-浓度来看,HAO活性高,但是NO2-浓度却变化不大,说明羟胺氧化产生更多的是N2O,也有可能是较高碳氮比和低DO的条件下异养硝化菌的硝化作用占了优势所致,有研究表明,在较高的有机物负荷下(COD/N>10)和低DO下异养硝化菌会占优势而进行硝化作用[25],硝化过程异养硝化比自养硝化能释放更多的N2O[26].

低碳氮比较高碳氮比条件下,缺氧段产生的N2O要多,是由于外源碳源不足,NO2-和N2O均利用内碳源进行反硝化,氧化亚氮还原酶竞争电子的能力较弱,反硝化过程出现N2O的积累;碳源充足,亚硝态氮还原酶和氧化亚氮还原酶同时利用外碳源进行反硝化,初始阶段产生的N2O在接下来的反硝化过程中被迅速还原为N2.N2O的溶解度较高,其吹脱过程较慢.同样的环境条件下,产生的N2O多,那么溶解性N2O也就多.C/N比在9.5下,缺氧段溶解性N2O很低,说明产生的N2O很少,但是气态N2O含量却很高,可能是因为密闭的环境,上一个周期好氧段产生的N2O积累所致.

结合图2、图4与图5可以看出,不同碳氮比下,好氧段N2O释放峰值出现的时间与DO密切相关,DO浓度大,好氧段N2O释放峰值出现的时间提前,结合图2氮浓度的变化规律推断出:NH4+-N的氧化结束后,系统不再产生N2O;释放的少量气体,是从污泥混合液中曝气吹脱出来的.亚硝化反应结束后,因缺乏电子供体NH2OH,HAO活性降低,氨氧化过程不再释放N2O.从溶解性N2O产生量来看,大多数N2O产生于好氧阶段,AOB能利用铵盐或氢作为电子供体将亚硝酸盐还原为N2O,即硝化菌反硝化,以及好氧羟胺氧化是N2O释放的可能机制.缺氧段因缺乏NO2-做电子受体,HAO酶不参与反应,此阶段产生的N2O与HAO酶的作用无关.因此HAO在缺氧段基本没有消耗,活性较好氧段高.在产气量较高的C/N比3.5和9.52个条件下HAO活性均明显高于C/N比6.5条件下的HAO活性.

由此推断,碳氮比及DO浓度变化引起N2O释放量变化的根本原因是DO导致硝化阶段N2O产生的主要途径发生了改变.低碳氮比条件下缺氧反硝化阶段产生的N2O将会在后续曝气过程中释放出来,导致N2O产量增加.提供适量的碳源保证充分的反硝化过程,是降低生物反硝化脱氮过程中N2O产量的重要途径.

3 结论

3.1 不同碳氮比对硝化与反硝化的HAO活性影响不同,导致不同阶段N2O的产生与释放的主要途径不同.缺氧段HAO较好氧段HAO活性高,是因为缺乏NO2-做电子受体,HAO酶不参与反应,此阶段产生的N2O与HAO酶的作用无关.好氧段N2O产生与碳氮比及DO均有关系,低碳氮比及低DO使得好氧反硝化碳源不足N2O积累,而HAO在低氧环境将羟胺氧化成了N2O.

3.2 在产气量较高的C/N比3.5和9.5 2个条件下HAO活性均明显高于C/N比为6.5条件下的HAO活性.高碳氮比(9.5)下好氧段N2O产生比低碳氮比还高,是因为高碳氮比下HAO酶活性高导致氧化羟胺变成N2O所致或是异养硝化菌硝化反硝化产生更多N2O所致.好氧段硝化(好氧羟胺氧化)是N2O产生的主要来源.

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* 责任作者, 教授, yuanlinjiang@xauat.edu.cn

Effect of carbon to nitrogen ratios of influent on the activity of hydroxylamine oxidase of the sludge and the produce/emission of nitrous oxide

WEI Yi-ni, HE Zhi-xian, YUAN Lin-jiang*

(School of Environmental and Municipal Engineering, Xi'an University of Architecture and Technology,Xi’an 710055, China)., 2016,36(5)：1417~1425

A sequencing batch reactor operated under anoxic /aerobic condition was used to investigate the activity of hydroxylamine oxidase (HAO) and the production/emission of nitrous oxide during nitrification and denitrification under three different carbon to nitrogen ratios of influent．The results show that when the carbon to nitrogen ratio was 3.5 and 9.5, the HAO activity was averagely 283.77~19.64U/g MLSS and 348.87~17.94U/g, respectively. When the carbon to nitrogen ratio was 6.5, thewas only averagely 246.45~23.30U/g MLSS. On the whole,in the anoxic period was higher than that in the aerobic period under the three conditions. The trend of variation of the HAO activity was positively correlated with the emission of N2O, dissolution of N2O and accumulation of nitrite nitrogen. They were highly consistent in variation in the aerobic period when the carbon nitrogen ratio was 9.5.The results imply: (1) N2O is mainly produced in the aerobic period during nitrification and aerobic oxidation of hydroxylamine is the major step of N2O formation; (2) In case of relatively insufficiency of carbon source (eg., C/N=3.5), the release of N2O depends on the activity of HAO. When the carbon source is relatively sufficient, there was no significant correlation between the N2O emission and the HAO activity in the anoxic period. This is considered due to the lack of electron acceptors nitrite that hinders the HAO to participate in the reaction. The activity of HAO is relatively higher when N2O is produced.

carbon to nitrogen ratio；hydroxylamine oxidase；nitrous oxide；SBR；nitrification；denitrification

X703

A

1000-6923(2016)05-1417-09

魏旖旎(1990-),女,陕西西安人,硕士研究生,主要研究方向为城市污水深度处理及污水脱氮除磷等研究.

2015-11-01

国家自然科学基金项目(51078304,50878180);西安建筑科技大学校青年科技基金项目(QN1137)