两种介体物质在漆酶降解磺胺类抗生素中的作用

丁惠君,吴亦潇,钟家有,邹斌春,张维昊*,楼 倩



两种介体物质在漆酶降解磺胺类抗生素中的作用

丁惠君1,2,3,吴亦潇1,钟家有2,3,邹斌春2,3,张维昊1*,楼 倩2,3

(1.武汉大学资源与环境科学学院,湖北 武汉 430072；2.江西省水利科学研究院,江西 南昌 330029；3.江西省鄱阳湖水资源与环境重点实验室,江西 南昌 330029)

通过比较两种介体物质丁香醛(SA)和1-羟基苯并三氮唑(HBT)对漆酶降解5种典型磺胺类抗生素的影响,考察了介体的起始浓度、pH值、反应温度、漆酶起始浓度等因子的影响,得到介体SA对漆酶催化降解磺胺类抗生素的效果更好.在漆酶+SA反应体系中,反应体系pH值为5~6,反应温度为30℃,SA起始浓度为0.5mmol/L,漆酶起始浓度为0.5mg/mL时,漆酶对5种磺胺类抗生素的降解效果最佳,降解去除率在15min时达到75%左右,1h内均达到97%以上. 本研究表明,适当的介体物质可大大提升漆酶对磺胺类抗生素的降解效果.漆酶在介体物质的作用下对抗生素类污染物的生态净化具有良好的应用潜力.

丁香醛；1-羟基苯并三氮唑；漆酶；磺胺类抗生素；降解

大量研究表明,抗生素普遍存在于自然环境中[1].抗生素长期、低剂量存在于环境中造成的细菌耐药性问题,被认为是抗生素环境污染可能产生的最大生态风险[2-3].传统的污水处理工艺并不能有效地去除抗生素[4].

漆酶(EC 1.10.3.2)是从紫胶漆树的分泌物中发现的一种蛋白质,它是一种含铜的多酚氧化酶,一般含4个铜离子,属于铜蓝氧化酶蛋白[5].近十多年来,利用漆酶催化氧化降解有机污染物得到广泛研究[5-7],漆酶具有氧化底物广泛、能耗低、效率高、环境友好等优越性能.近年来,开始有报道利用漆酶降解去除抗生素类药物.Shi等[8]利用FeO微纳米颗粒固定化漆酶降解磺胺类抗生素,发现在介体丁香酸的作用下,固定化漆酶在5min内可完全降解3种磺胺类抗生素.Suda等[9]利用游离漆酶处理四环素类抗生素,在介体HBT的作用下,强力霉素和金霉素在15min内被全部去除,而四环素和土霉素则在1h内被全部去除. Migliore[10]用真菌-侧耳去除土霉素的研究表明, 14d内土霉素被全部降解.

已有的研究主要针对一种或几种抗生素进行漆酶催化降解[11-12],取得了较好的降解效果.而环境水体中抗生素种类繁多,对多种甚至多类抗生素的同时去除是抗生素降解的一个研究方向.本研究探讨利用游离漆酶和介体体系同时降解5种磺胺类抗生素磺胺嘧啶(SD)、磺胺吡啶(SPD)、磺胺甲恶唑(SMX)、磺胺噻唑(STZ)和磺胺二甲嘧啶(SMZ)的去除方法,并探讨了2种典型反应介体物质在漆酶降解5种磺胺类抗生素中的不同表现及不同因素对抗生素降解的影响,旨在为水环境中多类抗生素的同时去除提供参考.

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

漆酶(Laccase from Tramete,³0.5U/mg)和磺胺类抗生素(磺胺甲恶唑、磺胺嘧啶、磺胺甲嘧啶、磺胺吡啶、磺胺噻唑及内标物:磺胺甲基嘧啶-D4*,³98.0%,基本性质见表1)均购自SIGMA-ALDRICH公司;1-羟基苯并三氮唑(HBT,98%)和丁香醛(SA,98%)均购自J&K公司;柠檬酸(³99.5%)和柠檬酸钠(³99.0%)购自国药集团化学试剂有限公司.其他试剂为分析纯以上.

表1 磺胺类抗生素的基本性质Table 1 Basic characteristics of sulfonamide antibiotics

光照振荡培养箱(ZQLY-180GF,上海知楚),紫外可见分光光度计(UV5500,上海普析),pH计(PHSJ-3F,上海雷磁仪器厂),超纯水系统(Direct- Q 5UV,Millipore),超高效液相色谱UPLC(安捷伦1290)串联三重四极杆二级质谱(安捷伦6460).

1.2 实验方法

1.2.1 磺胺类抗生素的漆酶降解 用甲醇配制浓度为100mg/L的5种磺胺类抗生素的混合母液;漆酶母液用不同pH值的柠檬酸缓冲溶液配置,母液浓度为5mg/mL;用纯水配制浓度为5mmol/L的介体HBT和SA母液.

在10mL的反应体系中,将漆酶母液、磺胺类抗生素母液、介体母液及缓冲溶液以不同体积混合,获得不同的反应起始条件.在设置的反应条件下以150r/min震荡反应3h,反应结束后加入10mL甲醇进行漆酶的灭活处理[13].测定不同条件下反应终止时混合溶液中5种抗生素的剩余含量.在获得各个参数的最优条件后,进行最优条件下的抗生素降解实验,分别在15,60,120, 180min取样,进行漆酶灭活后测定各抗生素的剩余含量.各处理组均设2个平行样.

反应介体的影响:在10mL的反应体系中磺胺类抗生素的反应浓度设为10mg/L,介体浓度为0.5mmol/L,漆酶浓度为0.5mg/mL;缓冲溶液采用酶活性较大的pH=4的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液.设置一个不加介体的对照组和一个仅加抗生素的空白对照组.

介体起始浓度的影响:在10mL反应体系中,磺胺类抗生素、漆酶反应浓度均不变,缓冲溶液为pH=4的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液.两种介体物质设置不同的起始浓度,浓度梯度为0,0.05,0.1, 0.5,1,2mmol/L.

pH值的影响:在10mL反应体系,磺胺类抗生素、漆酶和介体物质的浓度均不变,通过改变缓冲溶液的pH值来考察不同pH值对反应的影响.添加的缓冲溶液pH值的梯度为3,4,5,6,比较在不同pH值缓冲溶液中磺胺类抗生素的去除率.

反应温度的影响:在10mL的反应体系中,磺胺类抗生素、漆酶和介体物质的浓度均不变,缓冲溶液为pH=4的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液.将反应体系分别置于不同温度条件下进行反应,温度梯度设为30 ℃,40℃,50℃,60℃.比较反应后体系中磺胺类抗生素的剩余含量,确定反应的最佳温度.

漆酶起始浓度的影响:在10mL反应体系中,使漆酶起始浓度分别为0.05,0.1,0.5,1,2mg/mL,磺胺类抗生素和介体物质的浓度均不变,缓冲溶液为pH=4的柠檬酸缓冲溶液.

1.2.2 UPLC-MS/MS测定磺胺类抗生素 5种磺胺类抗生素采用UPLC-MS/MS进行检测分析.色谱柱为Eclipse Plus C18(100mm´2.1mm, 1.8μm, Agilent);流速 0.3mL/min,柱温 40ºC,进样体积10 μL;流动相:0.2%甲酸的2mmol/L乙酸铵溶液(A)-乙腈(B).测定采用梯度洗脱程序为:0~0.1min,95%~90%A;0.1~1.8min,90%~90%A; 1.8~2.8min,90%~87%A;2.8~6.9min,87%~51%A;6.9~7.5min,51%~95%A.离子化模式为ESI+,扫描模式为多重反应监测模式(MRM),干燥气温度325℃,干燥气流量5L/min,鞘气温度350℃,鞘气流量11L/min,雾化器压力45psi.使用内标法进行定量,线性范围为1~100mg/L,线性良好,精确度高,重复性好.各目标抗生素的母离子、子离子、碎裂电压、碰撞能量和保留时间等参数见表2.

表2 各目标抗生素的质谱参数和保留时间Table 2 Target mass spectrum parameters and retention time of antibiotics

1.2.3 数据处理 所有数据用Origin8.5软件处理.

2 结果与讨论

2.1 两种介体的对比

SA的结构式 HBT的结构式

图1 两种介体物质的结构式
Fig.1 The molecular formula of two mediators

本研究所选的丁香醛(SA)和-羟基苯并三氮唑(HBT)(图1)是2种常见的漆酶催化氧化介体物质[14].SA是一种小分子量的酚类化合物, HBT含有N—OH结构.漆酶催化氧化它们的机制主要是通过一个氢电子转移,使它们分别产生,在自由基的作用下氧化反应底物.

通过在漆酶降解磺胺类抗生素反应体系中分别加入SA和HBT两种介体,比较两种反应介体对磺胺类抗生素的催化氧化促进作用.如图2所示,相比不加介体的对照组,加入SA和HBT两种介体对漆酶降解磺胺类抗生素均有促进作用,其中加入SA介体处理组对5种磺胺类抗生素的降解率达到70%~90%,比不加介体的漆酶组和空白组均高出60%~70%左右;比加入HBT介体处理组高40%~60%;加入HBT介体处理组对5种磺胺类抗生素的降解率在16%~45%,略高于空白对照组和纯漆酶处理组.由此可见,纯漆酶组对磺胺类抗生素在反应时长内没有起到明显的催化氧化作用,而SA对漆酶降解磺胺类抗生素反应体系具有较好的促进作用.研究表明[14-15],由于漆酶的氧化还原电位不足以氧化磺胺类抗生素,因此单独的漆酶对磺胺类的降解作用非常有限.相对于HBT,SA中含有的甲氧基降低了苯氧基的氧化还原电位,同时又增加了其电子密度[8],使得SA更容易被漆酶氧化,发生氧化还原循环.

漆酶催化氧化底物的机理主要包括:酶分子对底物的作用、电子在酶分子中的传递、氧分子对酶分子的氧化[16].漆酶作为氧化还原酶,不仅可以直接氧化底物发挥催化作用,还可通过介导系统的协同作用催化其他底物,如图3.在纯漆酶反应体系中,氧化态的漆酶氧化还原态底物,生成还原态漆酶和氧化态底物;还原态漆酶又被氧气氧化,生成氧化态漆酶和水.氧化态漆酶继续氧化还原态底物.在漆酶介体反应体系中,氧化态漆酶首先从还原态介体中获得一个电子被还原,同时介体被漆酶氧化,接着氧化态的介体氧化还原态底物,还原态的漆酶又被氧气氧化.反应不断循环,直至还原态底物被全部氧化.

2.3 介体起始浓度的影响

如图4所示,介体SA和HBT对磺胺类抗生素的降解作用在0~2mmol/L内均随着起始浓度的增加而增大,其中 SA介体对磺胺类抗生素降解的促进作用均优于相应浓度梯度下的HBT介体.漆酶+SA体系中,5种磺胺类抗生素的降解率最高能达到90%以上.由此可以看出,介体SA对漆酶降解磺胺类抗生素的效果更好.文献[8]比较了9种木质素衍生介体物质对漆酶降解3种磺胺类抗生素的作用,发现S型介体(丁香酸、丁香醛和丁香酮)相对于其他类型介体具有最大的降解去除率.而Kourosh等[18]的研究则表明,在HBT的作用下,漆酶对2种磺胺类的降解去除率分别达到66%和77%.

SA的起始浓度在0.1mmol/L提高到0.5mmol/L后,抗生素的降解率有较大的提升幅度(幅度约为30%),而在0.5,1,2mmol/L下,随着SA浓度的提升,对磺胺类抗生素的降解去除作用提升幅度较小.考虑高浓度的SA对水环境具有一定的的毒性(经藻类毒性实验得到其EC50约为100mg/L),确定0.5mmol/L为SA的最佳起始浓度.

2.4 pH值的影响

在不同pH值的缓冲溶液中进行漆酶降解磺胺类抗生素的实验,比较反应后体系中磺胺类抗生素的去除率.以SA作为反应介体时,在pH=6的缓冲溶液中漆酶对磺胺类抗生素的降解去除率最高,5种抗生素的平均去除率均达到95%左右(图5a).以HBT作为反应介体时,在pH=5的缓冲溶液中漆酶对磺胺类抗生素的降解去除率相对最高,5种磺胺类抗生素的去除率为20%~ 60%(图5b).pH值主要影响漆酶的催化活性,真菌漆酶的最适pH值为酸性[16].本研究中,由于磺胺类抗生素的磺酰胺基(-SO2NH-)可解离出氢离子,使其具有一定的酸性(pH值约为5.2),加入到pH=6和pH=5的缓冲溶液中,反应体系最终的pH值均为5~6.这与文献[18]中利用游离漆酶在pH=5的体系中降解2种磺胺类抗生素的结论基本一致.

2.5 反应温度的影响

如图6所示,在漆酶+SA的反应体系中,随着反应温度的升高,磺胺类抗生素的降解率有下降的趋势,下降幅度在10%~20%.在漆酶+HBT的反应体系中,50℃时抗生素的降解率相对最大,30℃时降解率最小.总体而言,温度对两种反应体系去除率的影响均不大.

在各种反应条件下,磺胺甲恶唑(SMX)是5种磺胺类抗生素中去除率相对最低的一种,这可能与其氧化还原电位较高(1.098V)有关,即氧化还原电位越低越能被漆酶氧化[18-19].同时,这也说明磺胺甲恶唑在环境中相对较稳定,因此其潜在的环境风险值得关注.

2.6 漆酶起始浓度的影响

以SA作为反应介体时,不同起始浓度(0~ 2mg/mL)漆酶对磺胺类抗生素的降解去除效果差异性不大,除磺胺甲恶唑外,其他几类磺胺类抗生素的去除率均在75%~90%之间,平均去除率达到80%左右(图7a).由此可见,在实验反应浓度范围内,漆酶的浓度增加对磺胺类抗生素的降解没有明显的促进作用.而漆酶+HBT反应体系中,随着漆酶浓度的增大,5种磺胺类抗生素的去除率显示出基本一致增大的趋势(图7b).然而,在最大的漆酶起始浓度2mg/mL下,体系对抗生素的去除率最大只有50%~70%左右.推测两种介体反应体系中,介体SA的介导作用较强,从而降低了对漆酶浓度的要求;而HBT的介导作用相对较弱,这时漆酶的浓度对促进降解反应具有显著影响.

2.7 最优条件下磺胺类抗生素的降解去除效果

通过以上各参数优化,在最优条件下进行了漆酶+SA体系对5种磺胺类的降解实验.结果如图8所示,5种磺胺类抗生素的降解率在15min时达到75%左右,到1h时就达到97%以上,基本已经降解稳定.由抗生素对照组的降解去除率可以看出,5种抗生素中仅有磺胺吡啶不够稳定,3h后其自身降解率达到24%左右,其他4种抗生素自身降解率在10%以内.

本研究表明,漆酶在SA介体作用下能够同时显著降解5种磺胺类抗生素,在最优条件下降解率达到97%以上.这与文献[15]漆酶和介体反应体系能够对磺胺二甲嘧啶和磺胺间甲氧嘧啶降解的结论一致,该研究表明,脱苯胺和与介体的氧化耦合作用是磺胺类转化的主要途径.

3 结论

3.1 仅漆酶对磺胺类抗生素的降解作用非常有限.在介体作用下漆酶对磺胺类抗生素的降解作用则显著提升.对比两种典型的介体物质SA和HBT,发现SA对促进漆酶降解磺胺类抗生素的效果更好,各抗生素的去除率平均提升了40%~ 60%.

3.2 介体SA对磺胺类抗生素的降解作用在0~2mmol/L内随着起始浓度的增加而增大,但随着SA起始浓度的提升,体系对磺胺类抗生素的降解去除作用提升幅度较小,本研究确定0.5mmol/L为SA的最佳起始浓度.

3.3 在漆酶+SA反应体系中,体系pH值为5~6,反应温度为30℃,漆酶起始浓度为0.5mg/mL,SA的起始浓度为0.5mmol/L时,5种磺胺类抗生素的降解去除率在15min时达到75%左右,1h内达到97%以上.

3.4 适当的介体物质可大大提升漆酶对磺胺类抗生素的降解效果.漆酶在介体物质的作用下对抗生素类污染物的生态净化具有良好的应用潜力.本文对其降解机理的阐释还不够深入,磺胺类抗生素的降解产物及降解动力学亦有待进一步研究.

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* 责任作者, 教授, zhangwh@whu.edu.cn

Role of two mediators in sulfonamide antibiotics degradation by laccase oxidation system

DING Hui-jun1,2,3, WU Yi-xiao1, ZHONG Jia-you2,3, ZOU Bin-chun2,3, ZHANG Wei-hao1*, LOU Qian2,3

(1.School of Resource and Environmental Science, Wuhan University, Wuhan 430079, China；2.Jiangxi Provincial Institute of Water Sciences, Nanchang 330029, China；3.Jiangxi Provincial Key Laboratory of Water Resources and Environment of Poyang Lake, Nanchang 330029, China)., 2016,36(5)：1469~1475

Two kinds of mediators, namely syringaldehyde (SA) and1-hydroxybenzotriazole (HBT), were investigated in laccase oxidation system, regarding the degradation of five kinds of typical sulfonamide antibiotics. The influences of factors, such as the initial concentrations of mediators, pH, temperature and the concentration of laccase, were studied. The results showed that SA was more effective in mediating laccase oxidation of all five kinds of sulfonamide antibiotics. In laccase+SA reaction system, the optimum conditions for the degrading the sulfonamide antibiotics by laccase were: at pH5~6 and 30℃, and with initial concentrations of SA and laccase respectively 0.5mmol/L and 0.5mg/mL. The degradation rates reached around 75% in 15minutes and more than 97% within 1hour for all five kinds of sulfonamide antibiotics. This study showed that the appropriate mediator can greatly improve laccase oxidation. Laccase oxidation assisted by mediators has a good application potential for the ecological purification of antibiotic pollutants.

syringaldehyde (SA)；1-hydroxybenzotriazole (HBT)；laccase；sulfonamide antibiotics；degradation

X171,X131

A

1000-6923(2016)05-1469-07

丁惠君(1983-),女,江西丰城人,武汉大学博士研究生,高级工程师,主要从事环境新型污染物生态效应及生物转化.发表论文14篇.

2015-09-28

江西省水利厅重大科技项目(KT201412);水利部鄱阳湖水资源水生态环境研究中心基金项目(kfjj201403);国家重点基金项目(41331174);湖北省环境保护厅环保科研项目(2014HB08).