己烯雌酚降解菌固定化条件优化及其降解性能

凌婉婷,徐冉芳,刘 娟,孙敏霞,李舜尧,朱雪竹,高彦征



己烯雌酚降解菌固定化条件优化及其降解性能

凌婉婷,徐冉芳,刘 娟,孙敏霞,李舜尧,朱雪竹,高彦征*

(南京农业大学土壤有机污染控制与修复研究所,江苏 南京 210095)

以海藻酸钠为包埋剂,制备了己烯雌酚(DES)降解菌株S(sp.)的固定化菌剂,通过正交试验确定了菌株S的最佳固定化条件:海藻酸钠质量分数为4%,菌悬液与海藻酸钠重量比为1:2,CaCl2质量分数为4%,交联时间为6h.菌株S的固定化菌剂比游离菌株更有优势;7d时,固定化菌株S对无机盐培养基中DES的去除率为83.84%,较游离菌株高22.84%.优化了固定化菌株S对溶液中DES的处理条件:固定化菌株S接入量为300g/L,初始底物浓度为20~40mg/L.固定化菌株S对DES浓度为40.01,37.90 ,33.52μg/L 3个排污口污水中DES的去除率分别达90.0%,96.0%,96.7%.利用固定化菌株处理实际污水中DES等雌激素具有应用潜力.

雌激素；己烯雌酚；固定化；降解；污水

世界各国很多水体中均发现不同程度的雌激素污染,这对人群健康和生态安全产生不良影响[1-2].我国长江,黄河流域水体中也有雌激素检出.据报道,当水体中雌激素浓度为1ng/L时就会对鱼类的内分泌系统产生干扰,造成雄鱼雌性化现象[3-5].如何去除水体中雌激素已成为当前环境领域研究的热点之一.

雌激素性质稳定,单纯自然衰减无法消除雌激素污染,其残存效应风险很大.利用功能微生物来高效降解雌激素受到关注.研究者从污泥,土壤等介质中分离获得了多株雌激素降解菌[6-8].杨俊等[6]从制药污泥中分离了1株高效降解17β-雌二醇(E2)的菌株sp.,在最佳实验条件下,7d内该菌株可将初始浓度为0.5~50mg/L的17β-E2完全降解.Yoshimoto等[7]从污水处理厂活性污泥中分离了1株和3株,其中对雌激素具有强降解能力,24h内可将浓度为100mg/L的雌酮(E1),E2,雌三醇(E3)完全降解.从环境中筛选出具有雌激素降解性能的菌株,有望实现雌激素的高效降解.然而目前对于己烯雌酚(DES)降解菌的发现仍很少.

由于实际污水成分复杂,实验室筛选的功能菌株往往因不适应环境造成活性抑制,与土著微生物竞争处于劣势,且存在难以回用等问题,其应用受到限制[9].固定化微生物技术因具有生物密度大,耐环境冲击,可回收利用,反应过程易于控制,处理效率高等优点,弥补了游离菌株的不足,目前已被应用于一些有机污染物的处理[10-11].微生物固定化技术是在固定化酶技术的基础上发展起来的一种技术.海藻酸钠常被用作微生物固定化的包埋剂[12-13].须指出,迄今仍少有利用固定化菌剂来处理水中DES等雌激素的相关报道.

本研究在前期分离得到1株能够以DES为唯一碳源和能源的菌株S(sp.),在此基础上以海藻酸钠为包埋剂,采用正交试验法,以固定化菌株对DES的去除效率为主要指标,确定了菌株固定化条件;分析了固定化菌株S对无机盐培养基和实际污水中DES的去除性能.研究结果可为发展雌激素降解菌的固定化技术,治理雌激素污染等提供参考.

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验所用DES降解菌株S分离自南京某污水处理站的活性污泥,经鉴定为沙雷氏菌属(sp.)细菌[10].包埋剂选用海藻酸钠,为化学纯;交联剂选用CaCl2,为分析纯.DES购自上海阿拉丁试剂有限公司,纯度>98%.C18为分析纯.

LB培养基,无机盐培养基(MS),DES降解培养基参考文献[8].固体培养基加入2%的琼脂.

1.2 菌株S固定化菌剂的制备

以海藻酸钠质量分数(A),菌悬液与海藻酸钠的重量比(B),CaCl2浓度(C)及交联时间(D)为试验因素,采用正交试验法[12],设计4因子3水平的正交表(表1),以DES去除率为衡量指标来评价各固定化处理优劣.图1为固定化微生物小球制备流程.制备固定化菌剂的方法:菌株S分别接种于LB培养基,摇床30℃,150r/min振荡24h后,调600=1.0;将含菌株S的菌悬液按一定体积比混匀后,与海藻酸钠以一定的菌胶比充分混匀,匀速滴入4℃的CaCl2溶液后,于4℃交联一定时间,得到直径为3~5mm的固定化颗粒.用无菌生理盐水冲洗后使用.

表1 正交试验因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

1.3 菌株S固定化菌剂对溶液中DES的去除

在DES浓度分别为20,40,60,80,100mg/L的无机盐降解培养基中,按100,200,300,400,500g/L的接入量分别加入上述制备的各固定化降解菌剂,30℃,150r/min摇床培养0~7d后测定溶液中DES浓度,计算DES去除率.以接入相等菌量的游离菌剂的处理作为阳性对照,不接种微生物的空白小球的处理作为阴性对照.每个处理重复3 次.溶液中DES浓度测定采用整瓶提取培养基的方法[8].

1.4 菌株S固定化菌剂对污水中DES的去除

实际污水样品采自南京市区内某湖泊的三个污水排水口.将采集的水样1L经固相萃取柱富集浓缩(富集倍数500),经HPLC检测发现,3个生活污水排水口处的湖水中均检测到DES,浓度分别为40.01,37.90,33.52μg/L.

按海藻酸钠质量分数4%,菌悬液与海藻酸钠之比1:2,CaCl2浓度4%,交联时间6h的固定化条件制备固定化降解菌株S菌剂.按300g/L的菌剂接种量,在1L污水样中投入固定化降解菌株S菌剂,30℃,150r/min摇床振荡培养7d后,测定水样中DES含量,计算去除率.每个处理重复3次.

处理后的水样以约为5~8mL/L的流速通过已分别用5.00mL甲醇和5.00mL超纯水活化的装填有C18的固相萃取柱萃取,用5.00mL超纯水淋洗柱体并继续抽吸3.0min,淋洗后的萃取柱用15.00mL甲醇洗脱,洗脱液收集至玻璃试管中.试管置于40℃的恒温水浴并用氮气吹干,然后加入50%甲醇水溶液将附着物重新溶解至2.00mL,过0.22μm孔径滤膜后HPLC分析[8,14].

2 结果分析与讨论

2.1 菌株S最佳固定化条件

按照前述正交试验,制备了9种菌株S的固定化菌剂,研究了其对无机盐培养基中DES的去除性能,以去除率为指标评价了菌株S最佳固定条件.从图2可见,4个因子均显著影响溶液中DES的去除.利用正交试验的直观分析法,对其结果进行解析,得出4个因子对DES去除的影响大小顺序是:海藻酸钠浓度>菌悬液与海藻酸钠重量比>CaCl2浓度>交联时间.根据无机盐培养基中DES的去除率,选用菌株S的最佳固定化条件为:海藻酸钠浓度4%,菌悬液与海藻酸钠之比为1:2,CaCl2浓度为4%,交联时间为6h.该条件下制备的固定化菌剂形貌如图3所示.固定化菌株S呈球形,直径约为3~5mm.实验中也发现,海藻酸钠浓度为3~4%时,易成球;若海藻酸钠浓度为5%时,则易发生拖尾现象,成球较困难;段海明等[15]用海藻酸钠固定化细菌时发现类似现象.

2.2 菌株S固定化菌剂对溶液中DES的去除

2.2.1 固定化菌与游离菌去除DES的比较 以DES为唯一碳源,研究了菌株S的固定化菌剂和游离菌株对溶液中DES的去除作用,溶液中DES的起始浓度为50mg/L,游离菌株接入量与固定化菌剂中菌株接入量相同.由图4可见,供试时间内(0~7d),固定化菌剂对无机盐培养液中DES的去除率均显著地高于游离态菌株S.1d时,游离态菌剂对溶液中DES没有去除作用,这是因为开始阶段(0~1d)DES对游离态菌株的生长和活性产生一定抑制.1d时,固定化菌剂则去除了溶液中9.18%的DES,且与无菌株空白小球的去除率无显著差异,这表明,0~1d时固定化菌剂对溶液中DES去除主要依赖于海藻酸钙凝胶小球对溶液中DES的吸附作用.随着处理时间延长(1~7d),固定化菌剂和游离菌株处理的溶液中DES残留浓度均降低,去除率则不断升高;经7d处理后,固定化菌剂和游离态菌剂对溶液中DES的去除率分别达83.84%和68.25%,且远远大于无菌株空白小球的去除率.1~7d,无菌株空白小球对溶液中DES的去除率基本恒定,表明海藻酸钙凝胶小球对DES的吸附在1d时已达到饱和.

从去除机制来看,菌株S固定化菌剂对无机盐培养液中DES的去除主要包含两种作用,一是固定化小球(海藻酸钙)自身吸附DES,这可以从无菌空白小球对DES的去除得到证明,二是固定化小球中菌株S降解DES[9,16].0~1d时,固定化菌剂和无菌空白小球的处理能力一致,表明此时固定化菌剂对溶液中DES的去除主要归因海藻酸钙的吸附作用;1~7d,固定化菌剂去除溶液中DES性能不断提高,且与无菌空白小球的去除率间差距增大,而无菌空白小球的去除率则在1~7d保持不变,说明随着时间延长(1~7d),固定化菌剂对溶液中DES的去除从海藻酸钙吸附为主演变为固定化菌株S的降解为主;7d时,无菌空白小球处理的去除率仅为15.58%,而固定化菌剂处理的去除率则为83.84%,吸附机制所占贡献为15.58%,而菌株S降解则贡献了68.26%.

菌株S固定化菌剂比游离菌株有更好的处理效果,这一方面是因为形成固定化菌剂的海藻酸钙凝胶小球内部呈多孔道结构,对DES具有吸附作用,另一方面,固定化载体对菌株起到了保护作用,同时增加了菌体与DES的接触机会.DES在由固定化载体表面扩散至载体内部过程中,生长在载体孔道表层的菌落形成了一层保护屏障,增强了菌株抵抗能力,从而使得菌株能更好地生长和增殖[9,13],而游离菌株S在溶液中易受到DES毒害,生长受到抑制[17-18],故其降解DES的效率较低.

2.2.2 固定化菌剂接入量的影响 研究了固定化菌剂接入量对无机盐培养液中DES去除的影响,结果见图5.随着固定化降解菌接入量由0增大至300g/L,溶液中DES去除率显著增大;菌剂接入量为300g/L时,固定化降解菌对溶液中DES的降解率达85.2%.但当菌剂接入量继续增大(由300g/L增大至500g/L),溶液中DES去除率无显著提高.因此,固定化降解菌籍最适接入量为300g/L,该接入量既能保证溶液中DES较好的去除效果,也减少了固定化降解菌的使用量,从而可降低实际应用的原料成本.试验过程中,当固定化降解菌接入量较大时,降解体系较混浊,这可能是因为固定化降解菌以DES为碳源和能源物质,接入量较大时,细胞因缺乏足够营养而活性较低,出现了菌体自溶死亡现象,死亡的细胞物质渗出造成培养基浊度增加[15].

2.2.3 DES初始浓度的影响 图6为DES初始底物浓度对固定化降解菌去除溶液中DES性能的影响.当DES浓度较低时(20mg/L和40mg/L),固定化降解菌对无机盐培养液中DES的去除率较高,分别为86.8%和86.2%.随着底物浓度升高(20到100mg/L),固定化降解菌对DES的去除率下降.表明高浓度DES对菌株生长产生抑制作用,进而使得DES去除率减小.在实际使用中,应适时检测环境中DES的实际污染浓度,据此来进一步科学地确定固定化降解菌剂的使用量,进而节约成本并提高处理效能.

2.3 菌株S固定化菌剂对实际污水中DES的去除

固定化菌株S对实际污水中DES去除见图7,3个污水排水口处湖水中DES浓度分别为40.01,37.90,33.52μg/L.经固定化菌剂处理后,排水口1,排水口2,排水口3水样中DES去除率分别为90.0%,96.0%,96.7%.固定化降解菌株对实际污水中DES有较好的去除效果(去除率90.0%以上),可能是因为实际污水中DES浓度较低,且固定化载体对菌株具有一定的保护效果,菌株受到外界环境的毒害作用很小,故而表现出较好的降解效果.

本研究中固定化菌剂包菌量偏低,海藻酸钙吸附能力也不强,导致了处理无机盐培养液和污水中DES时菌剂投加量偏多,该问题仍需要进一步针对性地完善.研究结果表明,构建雌激素固定化菌剂,可高效地去除水中DES.固定化后菌株具有相对封闭和稳定的空间,能保证细菌正常代谢,屏蔽外界土著微生物恶性竞争,防止噬菌体吞噬等[8].固定化菌剂在治理污水中DES等雌激素方面有一定可行性和优越性,可为无害化处理污水中雌激素提供新思路和基础依据.

3 结论

3.1 以海藻酸钠为包埋剂,制备了菌株S的固定化菌剂,通过正交试验确定了菌株S最佳固定化条件:海藻酸钠质量分数为4%,菌悬液与海藻酸钠重量比为1:2,CaCl2浓度为4%,交联时间为6h.

3.2 菌株S的固定化菌剂比游离菌株更有优势.7d时,固定化菌株S对无机盐培养基中DES的去除率为83.84%,较游离菌株高22.84%.优化了菌株S的固定化菌剂对溶液中DES的处理条件:固定化菌剂接入量300g/L,初始底物浓度20~ 40mg/L.

3.3 菌株S的固定化菌剂对DES浓度为40.01, 37.90 ,33.52μg/L 3个排污口污水中DES去除率分别达90.0%,96.0%,96.7%;利用固定化菌株处理污水中雌激素具有应用潜力.

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* 责任作者, 教授, gaoyanzheng@njau.edu.cn

Immobilization and degradation performance of diethylstilbestrol-degrading bacteria S (sp.)

LING Wan-ting, XU Ran-fang, LIU Juan, SUN Min-xia, LI Shun-yao, ZHU Xue-zhu, GAO Yan-zheng*

(Institute of Organic Contaminant Control and Soil Remediation, College of Resources and Environmental Sciences, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)., 2016,36(5)：1514~1519

Diethylstilbestrol (DES)-degrading bacteria S (sp.) was immobilized using sodium alginate as the embedding agent. The optimum immobilization conditions, determined through orthogonal test, were as follows: 4% sodium alginate, bacteria: sodium alginate 1:2, 4% CaCl2and 6h crosslinking time. The DES degradation performance of immobilized strain S was apparently superior to that of free strain. The degradation ratio of DES by immobilized strain S was 83.84%, which was 22.84% higher than that by free strain S under laboratory culture conditions. The optimum inoculation of immobilized strain S was 300g/L, and the optimum initial DES concentration was 20~40mg/L. Three water samples were collected from sewage outfalls with DES concentrations of 40.01, 37.90 and 33.52μg/L, respectively. Immobilized strain S was added to these water samples, and 90.0%, 96.0% and 96.7% of DES were removed by immobilized strain S after 7d. Results of this investigation provide a new available technique for estrogen removal from polluted water systems.

estrogen；diethylstilbestrol；immobilization；degradation；sewage

X703.5

A

1000-6923(2016)05-1514-06

凌婉婷(1976-),女,贵州遵义人,教授,博士,主要研究方向为农业环境污染控制.发表论文80余篇.

2015-11-16

国家自然科学基金(51278252,21477056);江苏省环保科研课题(2015023);江苏省重点研发计划(社会发展)项目(BE2015682)