黄芩素对阿霉素肾病大鼠肾小管上皮细胞凋亡的调节作用*

吴 嘉 易铁钢（广州中医药大学深圳附属医院肾病科广东深圳518033）

黄芩素对阿霉素肾病大鼠肾小管上皮细胞凋亡的调节作用*

吴 嘉 易铁钢#
（广州中医药大学深圳附属医院肾病科广东深圳518033）

目的：探讨黄芩素对阿霉素肾病大鼠肾小管上皮细胞凋亡的调节作用。方法：18只雄性Wistar大鼠随机分为正常对照组（正常组，n=6）、阿霉素肾病组（模型组，n=6）和黄芩素治疗组（治疗组，n=6），模型组和治疗组一次性尾静脉注射阿霉素2.0 mg/kg诱导阿霉素肾病动物模型，正常组注射等量生理盐水。造模后第1天开始，治疗组予黄芩素300 mg/（kg·d）灌胃，正常组和模型组予等量蒸馏水灌胃，共治疗8周。8周时留取各组大鼠24 h尿液标本及肾脏组织标本，使用TUNEL检测肾小管上皮细胞凋亡，免疫组化检测肾组织中caspase-3表达，western Blot方法检测肾皮质中Bcl-2及caspase-3蛋白水平。结果：与正常组比较，模型组24 h尿蛋白定量明显升高（P＜0.05），肾小管上皮细胞凋亡数量明显增加（P＜0.05），肾皮质中caspase-3蛋白水平明显增加（P＜0.05），Bcl-2蛋白水平明显下降（P＜0.05）。与模型组比较，治疗组24 h尿蛋白定量明显下降（P＜0.05），TUNEL阳性肾小管上皮细胞数量明显减少（P＜0.05），肾皮质中caspase-3蛋白水平明显下降（P＜0.05），Bcl-2蛋白水平明显增加（P＜0.05）。结论：黄芩素对阿霉素肾病具有一定的保护作用，其作用机制可能与调节肾小管上皮细胞凋亡有关。

阿霉素肾病；黄芩素；肾小管上皮细胞凋亡；caspase-3；Bcl-2

阿霉素肾病（Adriamycin Nephropathy，AN）动物模型最早由Bertani等于1982年制作成功。其临床特点为大量蛋白尿，病理特点类似微小病变，早期仅表现为电镜下足突融合，后期逐渐出现肾小球硬化及肾小管间质纤维化［1］。作为典型的足细胞损伤模型，许多因素参与AN发生发展［2］，其中肾小管上皮细胞（Tubular Epithelial Cells，TECs）凋亡是导致肾小管损伤进而走向小管间质纤维化的重要因素［3］。中药单体黄芩素具有调节细胞凋亡和肾脏保护作用［4～5］。本研究拟从TECs凋亡角度探讨黄芩素对AN的保护作用。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物18只雄性Wistar大鼠，体重170～220 g，购自南方医科大学实验动物中心，适应性喂养1周，实验期间自由饮水、摄食。

1.1.2实验用药、试剂及主要仪器阿霉素（Sigma Aldrich，St.Louis，MI，USA），黄芩素（南京崇原生物有限公司），Bcl-2一抗（Sigma Aldrich，St.Louis，MI，USA），western blot浓度为1∶500，caspase-3一抗（Abcam，Cambridge，UK），western blot浓度为1∶200，免疫组化浓度为1∶20，二抗（Cell signaling Tec，MA，USA），免疫组化试剂盒（Maixin-Bio，Fuzhou，China），TUNEL检测试剂盒（德国Merck），大鼠代谢笼（Tecniplast S.p.a，Buguggiate，Italy），荧光显微镜（Nikon Corporation，Tokyo，Japan），垂直电泳仪（Bio-Rad，Hercules，CA，USA），转膜仪（Bio-Rad，Hercules，CA，USA），罗氏全自动生化分析仪。

1.2方法

1.2.1动物模型制作及干预将18只雄性Wistar大鼠随机分为正常组（n=6）、模型组（n=6）和治疗组（n=6），模型组和治疗组一次性尾静脉注射阿霉素2.0 mg/kg，正常组注射等量生理盐水。造模后第1天开始，治疗组予黄芩素300 mg/（kg·d）灌胃，正常组和模型组予等量蒸馏水灌胃，共治疗8周。

1.2.2标本采集与保存治疗8周后，使用大鼠代谢笼收集各组24 h尿液标本。肾脏组织标本采集步骤如下：10％水合氯醛按35 mg/100 g腹腔注射麻醉，沿腹正中线剖开腹腔，摘除肾脏，切取一半左肾用10％福尔马林固定，经脱水，透明，石蜡包埋，切片4 μm，行TUNEL及检测免疫组织化学染色。剩余肾脏组织分离皮髓质后冻存于-80℃冰箱，以备Western Blot检测。

1.2.3标本测定24 h尿蛋白定量（免疫比浊法），使用罗氏全自动生化分析仪。使用TUNEL检测TECs凋亡，免疫组化检测肾皮质中caspase-3表达分布，Western blot方法检测肾皮质中caspase-3及Bcl-2蛋白水平。

2结果

2.124 h尿蛋白定量与正常组比较，模型组24 h尿蛋白定量明显升高（P＜0.05），治疗组经黄芩素干预8周后明显下降（P＜0.05）。见图1。

图1　各组大鼠第8周时24h尿蛋白定量

2.2TUNEL阳性TECs数量与正常组比较，模型组TUNEL阳性TECs数量明显增加（P＜0.05），治疗组较模型组明显减少（P＜0.05）。见图2。

图2　各组大鼠8周时高倍镜视野下TECs凋亡计数

2.3肾组织中caspase-3表达分布免疫组化染色结果显示肾组织中caspase-3表达分布主要集中在肾小管，肾小球中也有少量表达，与TUNEL检测结果基本一致。见图3。

图3　各组大鼠8周时肾组织caspase-3免疫组化染色

2.4肾皮质中caspase-3和Bcl-2蛋白水平Western blot结果显示与正常组比较，模型组肾皮质中caspase-3蛋白水平明显增加（P＜0.05），Bcl-2蛋白水平明显下降（P＜0.05），与模型组比较，治疗组肾皮质中caspase-3蛋白水平明显下降（P＜0.05），Bcl-2蛋白水平明显增加（P＜0.05）。见图4。

图48　周时各组大鼠肾皮质caspase-3及bcl-2蛋白水平

3 讨论

细胞凋亡是细胞在一定信号刺激下出现的自主性、程序性细胞死亡，其过程受到严格的基因调控，在正常生理过程或病理条件下均可发生，是机体维持细胞数量平衡和清除异常及危险细胞的重要机制［6］。TECs凋亡在缺血性肾损伤、药物性肾损害、梗阻性肾脏病中均起到重要作用。慢性肾病状态下，持续蛋白尿所致TECs凋亡与小管萎缩程度及肾功能损害呈明显正相关［7］。

作为细胞凋亡的重要调节蛋白，caspase-3与Bcl-2的表达与TECs凋亡密切相关［8］。AN进展至8周时，TUNEL检测结果显示模型组大鼠TECs凋亡数量明显增加，这表明TECs凋亡参与了AN肾病的进展。免疫组化染色显示caspase-3主要分布于肾小管，肾小球中仅有少量表达，与TUNEL检测结果基本一致。肾皮质中caspase-3蛋白水平表达上调则进一步证实了肾组织中细胞凋亡的发生。肾皮质中Bcl-2蛋白水平表达下调则提示线粒体凋亡通路可能参与到TECs细胞凋亡进程。经黄

芩素干预8周后，治疗组24 h尿蛋白定量明显下降，表明黄芩素对AN有一定的保护作用。治疗组TECs凋亡减少，caspase-3蛋白水平下调，Bcl-2蛋白水平上调，提示黄芩素可能通过Bcl-2、caspase-3起到调节细胞凋亡的作用，但其具体的作用机制尚需进一步探讨。综上所述，本研究初步证实了黄芩素对AN具有一定的保护作用，其作用机制可能与调节TECs凋亡有关。

［1］Bertani T，Poggi A，Pozzoni R，et al.Adriamycin-induced nephrotic syndrome in rats：sequence of pathologic events［J］.Lab Invest，1982，46（1）：16-23

［2］Lee VW，Harris DC.Adriamycin nephropathy：a model of focal segmental glomerulosclerosis［J］.Nephrology（Carlton），2011，16（1）：30-38

［3］OhseT，InagiR，TanakaT，etal.Albumininducesendoplasmic reticulum stress and apoptosis in renal proximal tubular cells［J］. Kidney Int，2006，70（8）：1447-1455

［4］Lin M，Li L，Li L，et al.The protective effect of baicalin against renalischemia-reperfusion injury through inhibition of inflammation and apoptosis［J］.BMC Complement Altern Med，2014，14（1）：1-9

［5］Lee EK，Kim JM，Choi J，et al.Modulation of NF-kB and FOXOs by baicalein attenuates the radiation-induced inflammatory process in mouse kidney［J］.Free Radic Res，2011，45（5）：507-517

［6］Favaloro B，Allocati N，Graziano V，et al.Role of apoptosis in disease ［J］.Aging（Albany NY），2012，4（5）：330-349

［7］Erkan E，Garcia CD，Patterson LT，et al.Induction of renal tubular cell apoptosis in focal segmental glomerulosclerosis：roles of proteinuria and Fas-dependent pathways［J］.J Am Soc Nephrol，2005，16（2）：398-407

［8］Czabotar PE，Lessene G，Strasser A，et al.Control of apoptosis by the BCL-2 protein family：implications for physiology and therapy［J］. Nat Rev Mol Cell Biol，2014，15（1）：49-63

R692

Bdoi：10.13638/j.issn.1671-4040.2016.04.044

广东省自然科学基金（编号：2015A030313883）；广东省深圳市科技计划项目（编号：JCYJ20140408152909284，JCYJ20150401163247228）；广东省深圳市卫生计生系统科研项目（编号：201402079）
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易铁钢，E-mail：KOKYO_82@163.COM

（2016-03-18）