黄龙胆根黄酮类化合物的提取、纯化工艺研究

刘丽华, 周春娇，蒋红梅，王辉宪，杨华武，赵国玲

(1 湖南农业大学理学院, 湖南　长沙　410128；2 湖南中烟工业有限责任公司，湖南　长沙　410000)



黄龙胆根黄酮类化合物的提取、纯化工艺研究

刘丽华1, 周春娇1，蒋红梅1，王辉宪1，杨华武2，赵国玲2

(1 湖南农业大学理学院, 湖南长沙410128；2 湖南中烟工业有限责任公司，湖南长沙410000)

通过单因素与正交实验研究了微波辅助乙醇溶剂法提取黄龙胆根黄酮类化合物的最佳工艺条件，优化了大孔树脂对所得黄酮类化合物进行纯化的工艺。得出提取最佳工艺条件为：微波功率300 W，微波时间8 min，乙醇浓度35%，料液比1:20。在此条件下，得率为32.19%，粗提物总黄酮含量为1.97%。通过静态实验，选出最佳纯化树脂为AB-8大孔树脂；通过动态实验，得出吸附分离黄龙胆根黄酮类化合物工艺参数为：上样液流速2.00 mL/min，洗脱剂流速2.00 mL/min。经纯化后总黄酮含量为20.17%。

黄龙胆；黄酮类化合物；微波辅助法；提取；纯化；大孔树脂

黄龙胆(学名黄秦艽,龙胆科，黄秦艽属)，是重要的药用植物[1-2]，其根和茎入药具有清热、泻肝、定惊之功效。研究发现黄酮类化合物的功效是多方面的，它是一种很强的抗氧化剂[3-4]，许多黄酮类成分具有止咳、祛痰、平喘、抗菌、抗炎[5]、抗过敏[6]等活性。目前，偶有关于龙胆科植物黄酮类化合物的提取、含量的测定[7-8]、纯化[9]以及其中的各种成分分析[10-11]的报道，未有系统的关于黄龙胆中黄酮类化合物的提取及纯化工艺研究方面的报道。本文拟研究利用微波辅助乙醇溶剂法提取黄龙胆根黄酮类化合物的最佳工艺条件，并优化利用大孔树脂对提取所得的黄酮类化合物进行纯化的工艺。

1　材料、试剂与仪器

黄龙胆根，产自河北(晒干粉碎，过40目筛备用)；芦丁标准品，中国食品药品检定研究院；无水乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠，均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司产品；D101、HPD-100、HPD-300、AB-8、S-8等5种大孔吸附树脂，均为上海蓝季科技发展有限公司产品。

ST-08多功能粉碎机，永康市帅通工具有限公司；SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵，巩义市予华仪器有限责任公司；RE52C旋转蒸发仪，巩义市予华仪器有限责任公司DJ-5002；电子天平，美国康州HZ电子科技有限公司；UV-2450紫外分光光度计，日本岛津公司；LWMC-205可调功率微波化学反应器，南京凌江科技开发有限责任公司。

2　实验方法

2.1黄龙胆根黄酮类化合物的提取

2.1.1标准曲线的制备

准确称取干燥至衡重的芦丁标准品20.00 mg，用无水乙醇溶解并定容于100 mL容量瓶中，摇匀得浓度为0.20 mg/mL的标准溶液。移取上述芦丁标准溶液0.00 mL，0.50 mL，1.00 mL，2.00 mL，3.00 mL，3.50 mL，4.00 mL，5.00 mL于8支10 mL容量瓶中，分别加入5%亚硝酸钠溶液0.3 mL，摇匀放置6 min后再各加入10%硝酸铝溶液0.3 mL，摇匀放置6 min 后再各加入4% NaOH溶液4 mL，最后用无水乙醇定容至10 mL。以无水乙醇为空白参比，用紫外分光光度计于510 nm[12]处测定吸光度值，以吸光度Y为纵坐标，芦丁浓度X为横坐标，绘制标准曲线。

2.1.2单因素实验

采用微波辅助乙醇溶剂提取法提取黄龙胆根中的黄酮类化合物。通过单因素实验以提取液吸光度值为指标考察微波时间、微波功率、乙醇浓度、料液比、提取次数等因素对提取效果的影响。

称取5 g黄龙胆根粉末5份，分别置于500 mL圆底烧瓶中，各加不同浓度乙醇水溶液100 mL，在不同微波功率、不同微波时间、不同料液比条件下，进行提取，将提取液抽滤后用80%乙醇分别定容至100 mL，取该溶液0.5 mL于10 mL容量瓶中加显色剂显色(同2.1.1操作，下同)，用无水乙醇定容后，于510 nm处测吸光度，比较提取液的吸光度值，结果表明：微波时间、微波功率、乙醇浓度、料液比等因素对提取效果有显著影响。

2.1.3正交实验方案

根据单因素实验结果，设计4因素3水平的正交实验[12-13]，对微波辅助乙醇溶剂法提取黄龙胆根黄酮类化合物的工艺条件进行优化，正交实验设计如表1所示。

表1　黄酮类化合物提取L9(34)因素、水平设计

2.2提取物的纯化

2.2.1黄龙胆根总黄酮粗提液的制备

称取黄龙胆根粉末800 g，分多次按所得的最佳工艺条件提取黄龙胆根总黄酮，合并提取液浓缩至800 mL，取该溶液0.5 mL于10 mL容量瓶中加显色剂，用无水乙醇定容后于510 nm 处测吸光度，依据2.3公式可计算出其总黄酮浓度，所得黄龙胆根总黄酮粗提液用于以下纯化实验。

2.2.2树脂的筛选

准确称取经预处理[14]的5种干树脂各3 g，分别置于250 mL具塞三角瓶中，加入黄酮类粗提液各100.00 mL(2.2.1提取得到)，置于摇床中，20 ℃，90 r·min-1(温度与频率下同)，振荡吸收12 h，测定吸附后剩余液中黄酮类化合物浓度，按式(1)、式(2)分别计算吸附量Q1[15]和吸附率q1。将已吸附饱和的5种树脂过滤，分别置于250 mL具塞三角瓶中，加入100.00 mL 70%乙醇溶液，置于摇床中，解吸附6 h，测定解吸液中黄酮类化合物浓度，按式(3)、(4)分别计算解吸量Q2和解吸率q2。根据吸附量、吸附率和解吸量、解吸率对5种大孔树脂进行筛选。

Q1(mg/g)=(C0-C1)V1/M

(1)

(2)

Q2(mg/g)=C2V2/M

(3)

(4)

式中：Q1——吸附量,mg/g

q1——吸附率

Q2——解吸量,mg/g

q2——解吸率

C0——吸附原液黄酮类化合物质量浓度,mg/mL

C1——吸附后剩余液中黄酮类化合物质量浓度,mg/mL

C2——解吸液中黄酮类化合物质量浓度,mg/mL

V1——吸附液原液体积,mL

V2——乙醇体积,mL

M——干树脂质量,g

2.2.3吸附液pH对吸附效果的影响

准确称取经预处理的AB-8树脂3.00 g，共5份，分别置于250 mL具塞三角瓶中，分别加入pH为3、4、5、6、7的黄酮类粗提液100.00 mL，置于摇床中振荡12 h，测定吸附后剩余液中黄酮类化合物浓度，计算吸附量，比较静态条件下不同pH值对吸附效果的影响。

2.2.4最大吸附量的考察

准确称取经预处理的AB-8树脂3.00 g，共5份，分别置于250 mL具塞三角瓶中，分别加入pH=6的黄酮类粗提液40 mL、70 mL、100 mL、130 mL、160 mL，置于摇床中振荡12 h，测定吸附后剩余液中黄酮类化合物浓度，计算吸附量，确定静态条件下的最大吸附量。

2.2.5吸附时间对吸附效果的影响

准确称取经预处理的AB-8树脂3.00 g，置于250 mL具塞三角瓶中，加入pH=6的黄酮类粗提液160 mL，置于摇床中振荡12 h，每隔1 h测定溶液中黄酮类化合物浓度，计算吸附量，考察静态条件下吸附时间对吸附效果的影响。

2.2.6乙醇浓度对解吸附效果的影响

准确称取经预处理的AB-8树脂3.00 g，共5份，分别置于250 mL具塞三角瓶中，分别加入pH=6的黄酮类粗提液100 mL，置于摇床中振荡9 h，测定吸附后剩余液中黄酮类化合物浓度，计算吸附量。然后取出树脂分别置于层析柱中，用去离子水将饱和吸附树脂洗至流出液无色，再分别置于250 mL具塞三角瓶中并加入100 mL浓度为50%、60%、70%、80%、90%的乙醇溶液解吸6 h，测定解吸液中黄酮类化合物浓度，计算解吸量，比较静态条件下不同浓度乙醇对解吸附效果的影响。

2.2.7乙醇体积对解吸附效果的影响

准确称取经预处理的AB-8树脂3.00 g，共5份，分别置于250 mL具塞三角瓶中，分别加入pH=6的黄酮类粗提液100 mL，置于摇床中振荡9 h，测定吸收后剩余液中黄酮类化合物浓度，计算吸附量。然后取出树脂分别置于层析柱中，用去离子水将饱和吸附树脂洗至流出液无色，再分别置于250 mL具塞三角瓶中并加入浓度为70%的乙醇60 mL、100 mL、140 mL、180 mL、220 mL解吸6 h，测定解吸液中黄酮类化合物浓度，计算解吸量，比较静态条件下不同乙醇体积对解吸附效果的影响。

2.2.8解吸时间对解吸效果的影响

准确称取经预处理的AB-8树脂3.00 g，置于250 mL具塞三角瓶中，加入pH=6的黄酮类粗提液100 mL，置于摇床中振荡9 h，测定吸收后剩余液中黄酮类化合物浓度，计算吸附量。然后取出树脂分别置于层析柱中，用去离子水将饱和吸附树脂洗至流出液无色，再分别置于250 mL具塞三角瓶中并加入浓度为70%的乙醇140 mL，解吸60 min，每隔10 min测定解吸液中黄酮类化合物浓度，计算解吸量，比较静态条件下解吸时间对解吸效果的影响。

2.2.9上样液流速的确定

准确称取经预处理的AB-8树脂16.00 g，共3份，分别湿法装玻璃柱(φ22 mn×300 mn)，床体积(BV)和长度分别为76 mL 和20 cm，将pH=6的黄酮类粗提液分别以1.00 mL/min、2.00 mL/min、3.00 mL/min的流速上柱，分部收集流出液，每管收集10 mL收集20管，测定各部分流出液中黄酮类化合物浓度，计算漏出率(流出液与上样液中黄酮类化合物浓度的比值)，以各部分漏出率对上样液体积作图，确定动态条件下的最佳上样液流速。

2.2.10洗脱剂流速的确定

准确称取经预处理的AB-8树脂16.00 g，共3份，分别湿法装玻璃柱(φ22 mn×300 mn)，床体积(BV)和长度分别为76 mL和20 cm，将200 mL pH=6的黄酮类粗提液以2.00 mL/min的流速上柱，上柱完毕后用去离子水洗至流出液无色，再用70%的乙醇分别以1.00 mL/min、2.00 mL/min、3.00 mL/min的流速洗脱，分部收集洗脱液，每管收集10 mL收集20管，测定各部分洗脱液中黄酮类化合物浓度，以各部分洗脱液黄酮类化合物浓度对洗脱体积作图，确定动态条件下的最佳洗脱流速。

2.3黄龙胆根黄酮类化合物含量、得率的计算

根据Y-X曲线方程和下列公式计算提取液中黄酮类化合物浓度和含量。

黄酮类化合物浓度X(mg/mL)=(Y-0.0011)/11.4205×n

式中：Y——吸光值

n——稀释倍数

黄龙胆根黄酮类化合物含量=X×V/样品质量×100%

式中：X——黄酮类化合物浓度，mg/mL

V——溶液体积，mL

黄龙胆根黄酮类化合物得率=w1/w2×100%

式中：w1——黄酮类粗提物样品质量，g

w2——黄龙胆根原料质量，g

2.4利用AB-8大孔树脂对黄龙胆根黄酮类化合物的纯化

2.4.1黄龙胆根黄酮类化合物的提取和粗提物中黄酮含量测定

称取5 g黄龙胆根粉末，按最佳工艺条件进行提取得到黄酮类粗提液，浓缩、冷冻干燥得提取粗品，称重、计算得率。取该粗品50 mg，溶于无水乙醇至50 mL容量瓶，再移取2 mL至10 mL容量瓶中显色定容于510 nm波长下测定吸光度值，依据2.3公式计算得该溶液中总黄酮浓度、粗品总黄酮含量。

2.4.2黄龙胆根黄酮类化合物的纯化及纯化物中黄酮含量测定

按最佳纯化工艺条件纯化粗提液(2.2.1提取得到)，收集60 mL至120 mL的洗脱液浓缩成浸膏状，冷冻干燥得纯化样品。取该纯化样品50 mg，溶于无水乙醇，并用无水乙醇定容于50 mL容量瓶。移取该溶液2 mL至10 mL容量瓶中显色定容，于510 nm波长下测定得吸光度值，依据2.3公式计算得该溶液中总黄酮浓度、纯化样品总黄酮含量。

3　结果与讨论

3.1黄龙胆根黄酮类化合物的提取

3.1.1标准曲线

依据标准品芦丁浓度与测定所得吸光度值绘制标准曲线，示于图1。得到线性回归方程为：Y=11.4205X+0.0011，R2=0.9994。

图1　芦丁标准曲线

3.1.2正交实验结果

正交实验结果示于表2。

表2　微波辅助法提取黄酮类化合物正交实验结果

由表2极差分析可知，乙醇浓度对提取效果的影响最大，其极差值为0.025；微波时间对提取效果的影响最小，其极差值为0.007。四个单因素对提取效果影响顺序为：乙醇浓度>料液比>微波功率>微波时间。因此，最佳提取工艺条件为A3B2C1D2，即微波时间8 min，微波功率300 W，乙醇浓度35%，料液比1:20。

为了实验结果的准确性，称取黄龙胆根粉末进行验证实验，结果见表3。

表3　微波辅助提取黄酮类化合物验证试验

由表3可知，平行实验结果证明实验的重复性可靠，说明该工艺条件可行。

3.2黄龙胆根黄酮类化合物的纯化

3.2.1黄龙胆根总黄酮粗提液的制备

由2.2.1所得黄龙胆根总黄酮提取浓缩液，取该溶液0.5 mL于10 mL容量瓶中加显色剂，用无水乙醇定容后于510 nm处测吸光度为0.983，依据2.3公式得总黄酮浓度为1.72 mg/mL，所得黄龙胆根总黄酮粗提液用于以下纯化实验。

3.2.2树脂的筛选

5种树脂的静态吸附与解吸附实验结果如表4所示。

表4　不同树脂对黄龙胆根黄酮类化合物的静态吸附和解吸附结果

由表4可知，吸附量和吸附率最高的是S-8树脂，解吸量和解吸率最高的是AB-8树脂，综合考虑选择解吸量最大的AB-8树脂进行黄龙胆根黄酮类化合物粗提液的柱层析分离。

3.2.3吸附液pH对吸附效果的影响

不同pH条件下AB-8树脂对黄龙胆根黄酮类化合物吸附效果的影响如图2所示，由图2可知当pH=6时吸附量最大，而该黄酮类化合物提取液本身呈弱酸性pH约为5，因此稍加调节即可达到最佳吸附pH。

图2　吸附液pH对吸附效果的影响

3.2.4最大吸附量

吸附量考察结果如图3所示，由图3可得，当原液体积由130 mL加至160 mL时吸附量缓慢增大，因此可将160 mL时的吸附量视为AB-8树脂对该黄酮类化合物的最大吸附量，此时最大吸附量为30.13 mg/g。

图3　最大吸附量考察

3.2.5吸附时间对吸附效果的影响

吸附时间与吸附量的关系如图4所示，分析可知，随着时间增加该树脂对黄酮类化合物的吸附量随之增加，但在第9 h后吸附量没有明显增加，从节省时间角度考虑静态吸附9 h即可，此时吸附量为29.62 mg/g。

图4　吸附时间对吸附效果的影响

3.2.6乙醇浓度对解吸附效果的影响

乙醇浓度对树脂解吸附效果的影响如图5所示，分析可知，乙醇浓度70%时解吸量最大为22.90 mg/g，高于或低于70%时解吸量均减小。根据相似相容原理，不同浓度的乙醇对化合物的溶解力不同，推测70%乙醇的极性与黄龙胆根黄酮类化合物的极性更加接近。因此，选择70%乙醇浓度为洗脱剂更合适。

图5　乙醇浓度对解吸附效果的影响

3.2.7乙醇体积对解吸附效果的影响

乙醇体积对树脂解吸量的关系如图6所示，分析可知，乙醇体积从140 mL增至220 mL时解吸量增加不明显，140 mL时解吸量为24.75 mg/g，因此为节约洗脱剂，选择140 mL乙醇进行洗脱即可。

图6　乙醇体积对解吸附效果的影响

3.2.8解吸时间对解吸效果的影响

解吸时间与解吸量的关系如图7所示，分析可知，前30 min随着解吸时间的增加解吸量迅速提升，30 min之后随着时间增加解吸量没有明显提高，因此解吸时间30 min为宜，此时解吸量为24.63 mg/g。

3.2.9上样液流速的确定

图8　上样液流速与漏出率关系

不同流速下，以各部分漏出率对上样液体积作图，如图8所示，分析可知，当上样液流速为1.00 mL/min时泄漏点(泄漏点以流出液浓度为上样液浓度的1/10为标准)最晚出现，当上样液流速为3.00 mL/min时泄露点最早出现。这是因为流速慢时，黄酮类化合物与树脂的接触时间延长，有利于其从液相扩散到树脂相，有利于吸附；流速过快，被吸附物质来不及扩散到树脂表面就会发生泄漏。因此流速慢有利于吸附，但流速过慢会影响生产效率。综合考虑选择上样液流速2.00 mL/min为宜。

3.2.10洗脱剂流速的确定

不同流速下，以各部分洗脱液黄酮类化合物浓度对洗脱体积作图，如图9所示，分析可知，被洗脱的黄酮类化合物主要集中在60～120 mL的洗脱液中，而洗脱体积在60～120 mL时1.00 mL/min与2.00 mL/min的黄酮类化合物洗脱量接近，但1.00 mL/min的洗脱时间是2.00 mL/min的一倍，因此选择2.00 mL/min更为合适。

图9　洗脱剂流速与洗脱液浓度关系

3.3AB-8大孔树脂对黄龙胆根黄酮类化合物纯化效果的评价

3.3.1黄龙胆根粗提物中黄酮类化合物的含量

步骤(2.4.1)所得提取粗品，称重得1.61 g，按公式(2.3)计算得率为32.19%。取该粗品50 mg，溶于无水乙醇，按步骤(2.4.1)操作测定该粗提物溶液吸光度值为0.046，依据2.3公式计算得该溶液中总黄酮浓度为0.020 mg/mL，粗品总黄酮含量为1.97%。

3.3.2黄龙胆根提取物纯化后黄酮类化合物的含量及纯化效果

步骤(2.4.2)得到纯化样品。取该纯化样品50 mg，溶于无水乙醇，按步骤(2.4.1)操作测定该纯化样品溶液得吸光度值为0.462，依据2.3公式计算得该溶液中总黄酮浓度为0.202 mg/mL，纯化样品总黄酮含量为20.17%，较粗品含量提高10.24倍。

4　结　论

通过单因素和正交实验设计确定微波辅助乙醇法提取黄龙胆根黄酮类化合物的最佳工艺条件为：微波功率300 W，微波时间8 min，乙醇浓度35%，料液比1:20。按最佳工艺条件进行提取得率为32.19%。通过静态吸附与解吸实验确定黄龙胆根黄酮类化合物最佳纯化树脂为AB-8大孔树脂；通过动态吸附实验得出：上样液流速为2.00 mL/min，洗脱剂流速为2.00 mL/min。经纯化后提取物总黄酮类化合物含量由1.97%提高到20.17%，较粗品提高10.24倍。

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Study on Extraction and Purification of Veratrilla Baillonii Franch Flavonoids Components

LIULi-hua1,ZHOUChun-jiao1,JIANGHong-mei1,WANGHui-xian1,YANGHua-wu2,ZHAOGuo-ling2

(1 College of Technical Science, Hunan Agricultural University, Hunan Changsha 410128;2 China Tobacco Hu’nan Industrial Co., Ltd., Hunan Changsha 410128, China)

The optimum extraction process condition of flavonoids from Veratrilla baillonii Franch by using microwave-assisted ethanol solvent method was studied, and the extraction of flavonoids were purified by using macroporous resin. Results showed that the best process conditions for the extraction were as follows: microwave power was 300 W, microwave time was 8 min, the ethanol concentration was 35%, the ratio of material to solvent was 1:20, the yield of crude flavonoids was 32.19%, the content of flavonoids was 1.97%. AB-8 was the best resin. Under the dynamic condition, the sample liquid flow velocity was 2.00 mL/min, the eluent flow velocity was 2.00 mL/min. The contents of flavonoids were 20.17%.

gentian; flavonoids; microwave assisted method; extract; purification；macroporous resin

王辉宪，研究方向: 天然产物提取与应用。

A

1001-9677(2016)05-0124-06