卵黄和十二烷基硫酸钠添加量对犬精子冻后活率的影响

李祥平

（1.天津药物研究院新药评价有限公司，天津　300301；2.天津农学院，天津　300301）

卵黄和十二烷基硫酸钠添加量对犬精子冻后活率的影响

李祥平1，2

（1.天津药物研究院新药评价有限公司，天津300301；2.天津农学院，天津300301）

本试验以Trjs-葡萄糖稀释液为基础稀释液，就卵黄（20%、25%、30%）和十二烷基硫酸钠（SDS）的添加量（0.725 mg/ml、1.000 mg/ml、1.500 mg/ml）对犬精子冻后活率的影响进行了研究。试验结果表明，（1）20%的卵黄添加量组犬精子的冻后活率最高。25%卵黄添加量组和30%卵黄添加量组比较则没有明显差异（F＜F0.05）。（2）添加SDS与对照组比较，添加SDS组的精子冻后活率都较高。三种SDS添加量中，1.000 mg/ml的添加量效果最好，冻后精子活率极显著（F＞F0.01）或显著（F＞F0.05）高于添加量为0.725 mg/ml和1.500 mg/ml时的冻后精子活率。

犬精子；冷冻；卵黄；十二烷基硫酸钠

1 材料和方法

1.1实验动物

雄性德国牧羊犬一只，6岁，体况中等，身体健康，精液品质较好。

1.2实验器械和试剂

1.2.1实验器械

集精杯、恒温恒湿、培养箱、离心机、显微镜、电子天平、细管精液冷冻仪。

1.2.2实验试剂

Tris、柠檬酸、葡萄糖、丙三醇、十二烷基硫酸钠、卵黄

1.2.3稀释液配方

（1）基础稀释液（Tris-葡萄糖稀释液）

Tris 3.04%，柠檬酸1.7%，葡萄糖1.25%，双蒸水配置。

（2）稀释Ⅰ液（V/V）

试验一：80%基础稀释液 + 20%卵黄；

75%基础稀释液 + 25%卵黄；

70%基础稀释液 + 30%卵黄。

试验二：80%基础稀释液 + 20%卵黄；

80%基础稀释液 + 1.45mg/ml SDS + 20%卵黄；

80%基础稀释液 + 2mg/ml SDS + 20%卵黄；

80%基础稀释液 + 3mg/ml SDS + 20%卵黄；

（3）稀释Ⅱ液（V/V）

90%稀释Ⅰ液+10%甘油。

1.3实验方法

1.3.1公犬保定

双腿夹住颈部保定。

1.3.2人工按摩采精

采精者左手握住阴茎向后推包皮使球体露出，反复按摩球体。当犬的尾部和后肢出现摆动时，右手握住集精杯准备接精，收集精液的中间部分。

1.3.3鲜精品质评定

采出的精液要检查色泽、气味、射精量、精子活力和密度等。

1.3.4鲜精的处理、降温及平衡

将鲜精装入塑料试管中，用记号笔标注精液的体积，以1500rpm离心5min，弃掉上清液，加入基础稀释液至试管标线处，混合后以同样的方法进行二次离心，弃上清液，加入适量的与鲜精等温的稀释Ⅰ液进行稀释并混匀。棉塞封口，放入盛有400ml30℃热水的500ml烧杯中，4℃冰箱中降温。18h后，将等体积的已预冷至4℃的稀释Ⅱ液缓慢加入精液中，混匀后放回4℃冰箱，平衡4h。

1.3.5冻前准备和冷冻

（1）冻前准备

（1）冻前检查精子活率，并记录。

（2）测量液氮面高度。

（3）细管冷冻插座预冷：使温度降为-70℃。

（4）装管。

（2）冷冻

将装有精液的细管插入已预冷的细管冷冻插座内，立即放入液氮罐内液面上方要求的高度进行熏蒸，10min后提出细管冷冻插座，取出细管，立即放入冷冻提筒内投入液氮。

（3）解冻和冻后精子活率的检查

从液氮中取出细管，放入70℃的水中7秒进行解冻。解冻后在400倍镜下进行精子活率判定。

1.4实验结果统计

实验数据按单因子试验进行统计分析，并按F检验进行显著性检验。

2 实验结果

2.1卵黄添加量对犬精子冻后活率的影响

表1　卵黄添加量对犬精子冻后活率的影响

从表 1 看，三种卵黄添加量组中，20%的卵黄添加量组犬精子的冻后活率最高，极显著优于25%卵黄添加量组和30%卵黄添加量组（F>F0.01）。25%卵黄添加量组和30%卵黄添加量组比较则没有明显差异（F＜F0.05）。

2.2十二烷基硫酸钠添加量对犬精子冻后活率的影响

表2　十二烷基硫酸钠（SDS）添加量对犬精子冻后活率的影响

从表 2 试验结果来看，与对照组比较，添加SDS组的精子冻后活率都较高。其中，SDS添加量为1.000 mg/ml和1.500 mg/ml时，冻后精子活率极显著（F>F0.01）或显著（F> F0.05）高于对照组。

3 讨论

3.1卵黄对犬精子冻后活率的影响

卵黄能维持稀释液的胶体渗透压，保护精子质膜和顶体膜免遭阳离子肽损害［1］［2］。为了提高犬精子的冻后活率，我们对卵黄添加量进行了进一步研究。从表1试验结果来看，卵黄添加量以20%为最好，冻后活率明显好于卵黄添加量为25%和30%时的冻后活率。这与大多数研究报道和生产实践中常用20%的卵黄添加量相吻合。为什么增加卵黄添加量精子的冻后活率反而出现下降，可能因为卵黄添加增加使稀释液中其它成分的浓度降低所致。

3.2SDS对犬精子冻后活率的影响

1972年Graham等人［3］首先报道了在精子稀释液中添加Orvus ESPaste（氨基-钠-十二烷基硫酸脂，OEP）可以减少冻融过程对精子的损伤。

由于OEP含有SDS，所以本试验直接选用SDS就其对犬精子冻后活率的影响进行了研究。从表2试验结果来看，精液稀释液中添加SDS确实能够提高冻后犬精子的活率。

4 结论

（1）三种卵黄添加量中，20%的卵黄添加量冷冻效果最好，冻后精子活率极显著高于卵黄添加量为25%和30%时的冻后精子活率。

（2）SDS添加量为1.000 mg/ml和1.500 mg/ml时，冻后精子活率极显著（F>F0.01）或显著（F>F0.05）提高。三种SDS添加量中，1.000 mg/ml的添加量效果最好。

［1］Cardoso RDS etal Cryopreservation of canine semen using a coconut water extender with eggyolk and three different glycerol concentrations［J］.Therio -genology，2003，59（3-4）：743-751.

［2］潘寿文，刘湖，马大君.犬的精液冷冻技术.畜牧与兽医［J］，1986 （3）：105-106.

［3］Graham C D，Graham E F.Some factors influencing the freezing of boar spermatozoa［M］.In：Proceeding of theSeventh International Congress on Animal Reproduction.MunichⅡ，1972：1627-1632.