SD大鼠胰腺组织在聚焦超声消融损伤后的血管生成

敖　澜，刘　清，胡　娜，赵紫豪，胡海霞，方廖琼，*

（1.西南大学生物技术学院，重庆　400716；2.重庆医科大学生物医学工程学院省部共建超声医学工程国家重点实验室超声医学工程重庆市市级重点实验室，重庆　400016）

SD大鼠胰腺组织在聚焦超声消融损伤后的血管生成

敖澜1，刘清1，胡娜1，赵紫豪1，胡海霞2，方廖琼1，2*

（1.西南大学生物技术学院，重庆400716；2.重庆医科大学生物医学工程学院省部共建超声医学工程国家重点实验室超声医学工程重庆市市级重点实验室，重庆400016）

目的通过检测经聚焦超声（FUS）消融的SD大鼠胰腺组织凝固性坏死区中Tie-2受体mRNA的表达和组织学结构变化，探讨FUS消融对凝固性坏死组织的血管生成的影响。方法随机将4～6周龄的SPF级SD大鼠60只分为FUS组（50只），对照组（10只）。FUS局部消融SD大鼠胰腺组织后，分别取消融后1周，2周，1个月，3个月，6个月和对照组的胰腺组织。用RT-PCR的方法，以GAPDH基因为内参，进行半定量分析检测Tie-2 mRNA的表达；同时HE染色、光学显微镜下观察凝固性坏死区组织学的变化；免疫组织化学方法检测胰腺组织中Tie-2的表达。结果RT-PCR检测到Tie-2 mRNA在对照组和FUS消融组织中均有表达。与对照组相比，FUS消融后1、2周Tie-2 mRNA的表达量降低（P＜0.01），消融后1个月mRNA表达量增多，于消融后3个月达到最大值（P＜0.01），消融后6个月表达量逐渐降低，但仍高于对照组（P＜0.01）。组织学表明，FUS消融后在凝固性坏死区有新生血管的逐步形成。免疫组织化学表明，在正常的胰腺组织中有Tie-2的表达，但在FUS消融胰腺组织中Tie-2的表达增多。结论在FUS消融后6个月内，大鼠胰腺凝固性坏死区域内有新生血管的生成，且比正常血管生成速度快。

血管生成；超声，聚焦；胰腺；大鼠，Sprague-Dawley

血管生成发生在许多生理和病理的过程中，包括胚胎发育、损伤修复和肿瘤的生长［1-3］。Tie-2是内皮特异性受体酪氨酸激酶家族的成员［4-5］，主要表达在内皮细胞上，在成体的血管组织中，Tie-2起了重要的作用，其能够在缺血、缺氧及炎症存在的情况下表达上调［6］。Tie-2是血管生长、重构的重要调节因子［7］，并可能有促进血管生成和维持血管稳定性的作用［8］。聚焦超声（focused ultrasound，FUS）是近年兴起的一种肿瘤治疗技术，已用于实体肿瘤的临床治疗，其可在短时间（0.5～1.0 s）内使靶点迅速升温并发生蛋白质变性和不可逆的凝固性坏死，而且不损伤其覆盖的和周围的重要器官［9-10］。胰腺具有内分泌和外分泌的功能且有一定的自我修复能力［11］，其功能活跃，血液循环丰富。FUS虽已用于胰腺癌等疾病的治疗并取得了一定疗效［12］，但基础研究的匮乏阻碍了其进一步发展。FUS消融胰腺是否会影响胰腺修复过程中的血管生成鲜有报道。本研究通过RT-PCR和组织学及免疫组织化学方法检测Tie-2的表达，以初步探讨FUS消融SD大鼠胰腺后凝固性坏死区组织血管生成的过程。

1　材料与方法

1.1实验动物与分组选取4～6周龄的SPF级SD大鼠60只，体质量130～150 g，雌雄各半，随机分为2组：FUS组（50只），对照组（10只），由重庆医科大学实验动物中心提供。本研究通过重庆医科大学生物医学研究委员会批准。

1.2FUS消融大鼠胰腺SD大鼠术前12 h禁食，不禁饮。经3%戊巴比妥钠（1.2 ml/kg体质量）腹腔注射麻醉后，备皮，将动物固定于手术板上，脱毛处理，常规消毒铺巾。于剑突下0.5 cm处沿正中线依次切开皮肤、肌肉层，并挑破腹膜，暴露腹腔，挤压左腹部致胃暴露，然后轻柔牵扯胃体暴露全部胰腺。FUS设备（CZF，重庆海扶技术有限公司）换能器频率为9.7 MHz，输出功率5 W。辐照时，将探头垂直紧贴胰腺，采用无菌生理盐水作为耦合剂，移动治疗头从点到线再到面，在每一个治疗点停留6 s直至出现可见的凝固性坏死，然后移动到下一个治疗点，完成后逐层关腹。对照组未开启治疗头能量，其他操作均一致。

1.3组织学与免疫组织化学检查将FUS组大鼠分别于消融后1周、2周、1个月、3个月、6个月处死，每个时间点取10只，获取胰腺组织，采用4%多聚甲醛固定，常规石蜡切片，HE染色观察组织病理学变化，免疫组织化学观察组织Tie-2的表达。一抗为兔抗大鼠的Tie-2多克隆抗体（sc-9026，Santa Cruz Biotechnology），二抗为抗兔的免疫球蛋白（PV-9001）。反应产物按DAB试剂盒（ZLI9018）说明进行染色。光学显微镜（BX51，Olympus）下观察拍照，内皮细胞膜上出现棕黄色颗粒为阳性表达。每张切片随机选择5个高倍镜视野计分：阳性细胞数＜10%为0分；10%～30%为1分；＞30%～50%为2分；＞50%～70%为3分；＞70%为4分。同时按着色强度计分：染色弱，呈淡黄色者为1分；染色中等，呈黄色者为2分，染色强，呈棕黄色者为3分。两种计分相加（0～7分）：0分为阴性（-）；1～2分为弱阳性（+）；3～4分中度阳性（++）；5～7分强阳性（+++）。

1.4Tie-2 mRNA水平检测剩余胰腺部分取其凝固性坏死区组织，利用Trizol提取总RNA（Trizol试剂说明书），经电泳鉴定其完整性，NanoDrop2000酶标仪（赛默飞）测定RNA浓度和OD 260/280比值。各取2 μg总RNA经反转录反应生成cDNA，以2 μl cDNA为模板进行RT-PCR，总体积为50μl，检测Tie-2表达水平随时间的变化情况。Tie-2引物序列：5'-TCCCTACCTCTTGTGTCTGA-3'/5'-CCTGTCCACGGTCATAGTTA-3'；以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）作为内参照，其引物序列为：5'-AACGACCCCTTCATTGAC GG-3'/5'-TCCACGACATACTCAGCAC-3'。扩增片段的长度分别为315、190 bp。PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳进行分析。每个时间点各取10只大鼠，每只取3次电泳结果进行计算及图像处理，以GAPDH为参照进行半定量分析。

1.5统计学分析采用SPSS 20.0统计分析软件。数据以±s表示，采用独立样本t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1血管生成的组织学特征HE染色后可见FUS消融后1～2周，辐照区细胞结构被破坏，胞质淡染，细胞轮廓不明显，只有少量的血管结构；辐照后1个月，凝固性坏死开始被逐渐吸收，被吸收部分呈网状结构，损伤灶可见新生血管结构；辐照后3～6个月，凝固性坏死被大量吸收，损伤灶区域可见大量的新生血管结构。见图1。

2.2胰腺组织细胞Tie-2的表达免疫组织化学染色发现，在正常胰腺组织已存在的血管中，Tie-2在内皮细胞中呈弱表达（图2A），FUS消融1个月后，Tie-2表达量逐渐增多，在消融后3个月时Tie-2的表达量达到最大（图2B），强阳性率为19.9%，而对照组强阳性率为4.5%（图2C）。

图1　FUS消融大鼠胰腺后，各时间点胰腺组织病理图（HE，×200） A.正常的胰腺组织；B.FUS消融1周后的胰腺组织；C.FUS消融2周后的胰腺组织；D.FUS消融1个月后的胰腺组织；E.FUS消融3个月后的胰腺组织；F.FUS消融6个月后的胰腺组织　箭示血管

图2　Tie-2在SD大鼠胰腺正常组织和FUS消融后组织的表达　A.Tie-2在胰腺组织已存在的血管中呈弱阳性表达（DAB，×200）；B.FUS消融后3个月时Tie-2在消融组织的表达（DAB，×200）；C.2组FUS消融后3个月Tie-2的强阳性率比较

2.3胰腺组织Tie-2 mRNA表达水平RT-PCR的结果显示Tie-2在正常胰腺组织和消融胰腺组织中均可有表达（图3），GAPDH mRNA作为内参在所有样本中均可检测到。FUS消融后1、2周时，与对照组相比，FUS组Tie-2 mRNA的表达量明显降低（P＜0.01）；在消融后1个月时，mRNA表达量增多，在消融后3个月达到最大值，与对照组相比差异均有统计学意义（P均＜0.01）；消融后6个月时表达量逐渐降低，但仍高于对照组（P＜0.01），见图4。

图3　Tie-2 mRNA　在对照组和FUS组中表达的RT-PCR分析从左到右依次为条带1～6。条带1：正常胰腺组织；条带2：消融后1周的胰腺组织；条带3：消融后2周的胰腺组；条带4：消融后1个月的胰腺组织；条带5：消融后3个月的胰腺组织；条带6：消融后6个月的胰腺组织

图4　RT-PCR检测在对照组和FUS组中Tie-2 mRNA的相对表达量　（*：与对照组相比，P＜0.01）

3　讨论

FUS是一种非侵入性的治疗方法，其将来自体外装置的超声能量聚焦使靶区产生凝固性坏死和细胞凋亡［13-14］，损伤区的凝固性坏死组织会逐渐被吸收，进而被新生的组织替代，以达到治疗的目的，且不会引起周围组织的损伤。血管生成在组织形成的过程中起重要作用，因为再生组织需要新生血管供给必需的氧气和营养物质。胰腺是一个重要的敏感器官，其本身具有一定的自我修复能力。本研究发现，FUS消融SD大鼠胰腺后，随着时间的推移，凝固性坏死逐渐被吸收，同时新生血管逐渐产生，说明FUS不仅能使组织产生凝固性坏死，而且能促进组织再生过程中的血管生成。

Tie-2是内皮细胞上特有的酪氨酸激酶受体之一［15-16］，并且这些激酶在胚胎血管发育的过程中发挥着重要作用［17-18］。研究［19-21］报道，在与损伤修复和乳腺癌相关的内皮细胞的血管生成中，Tie-2受体表达上调，且这些研究均证明Tie-2受体在血管生理学和病理学中起重要作用。但FUS消融后，组织修复的过程中Tie-2表达是否受到影响尚未知。本研究检测到Tie-2 mRNA在正常胰腺组织和消融胰腺组织中均有表达，FUS消融后1周和2周，Tie-2 mRNA表达量降低，在消融后1个月，mRNA表达量增多，于消融后3个月达到最大值，与免疫组织化结果相同，在消融后6个月，表达量逐渐降低。研究［22］报道在皮肤损伤修复的血管生成中也涉及Tie-2表达的上调，说明Tie-2在血管生成中起到重要的作用。FUS消融胰腺组织后1周，检测到Tie-2 mRNA表达量降低，说明FUS消融后仍有血管存在，可能是由于FUS只破坏2 mm以下的小血管。Hynyen等［23］用 FUS照射直径小于0.2 mm的肿瘤微血管后，血管立即破坏，血管内皮细胞消失，基底膜出现裂隙。这些结果均表明，FUS辐照SD大鼠胰腺后，有新生血管形成，且比正常血管形成速度快，故FUS与血管生成的过程有关。在辐照区血管生成速度加快的原因可能是由于FUS辐照后，虽对胰腺有一定的破坏作用，但同时胰腺有一定的自我修复能力，在损伤后的修复过程中，需血管提供充分营养，因此损伤后的血管生成速度变快，但具体的机制还需进一步研究。

综上所述，FUS对血管生成具有一定的促进作用，有望为一些血管性疾病的治疗带来新的思路。同时，利用FUS治疗胰腺癌等疾病，要特别注意消融损伤对血管的影响，消融完全彻底才会达到满意的治疗效果。

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Angiogenesis after focused ultrasound ablation on pancreas of SD rats

AO Lan1，LIU Qing1，HU Na1，ZHAO Zihao1，HU Haixia2，FANG Liaoqiong1，2*
（1.College of Biotechnology，Southwest University，Chongqing 400716，China；2.State Key Laboratory of Ultrasound Engineering in Medicine Co-founded by Chongqing and the Ministry of Science and Technology，Chongqing Key Laboratory of Ultrasound in Medicine and Engineering，College of Biomedical Engineering，Chongqing Medical University，Chongqing 400016，China）

ObjectiveTo evaluate the effect of angiogenesis of coagulation necrosis tissue and the Tie-2 expression after focused ultrasound（FUS）ablation on the pancreas of SD rats by detecting the expression of Tie-2 mRNA and the histologic structure changes.MethodsTotally 60 healthy SD rats of 4 to 6 weeks age were randomly divided into FUS group（n=50）and control group（n=10）.Ablated pancreatic specimens were obtained at 0（normal pancreas），the 1st week，the 2nd week，the 1st month，the 3rd month and the 6th month after FUS focal ablation for RT-PCR，histology and immunohistochemical analysis.The Tie-2 mRNA expression was detected by half quantitative analysis using RT-PCR method.Pancreatic tissue was dyed with HE stain and examined pathologically under an optical microscope for the coagulation necrosis area.Furthermore，the expression of Tie-2 was observed by immunohistochemistry.ResultsExpression of Tie-2 mRNA was detected in normal pancreatic tissue and the abated tissues by RT-PCR.Compared with the control group，expression of Tie-2 decreased on the 1st and 2nd weeks after FUS ablation（P＜0.01），but mRNA expression increased on the 1st month and reached a maximum on the 3rd month（P＜0.01），and the expression gradually reduced on the 6th month after FUS ablation，but the level was still higher than the control group.Histology showed that formation of new blood vessels were observable at the ablation area after the treatment.Immunohistochemically，Tie-2 was expressed in the pre-existing vessels of the normal pancreatic tissue，and Tie-2 expression increased in the ablated pancreatic tissue.ConclusionIn the period of the 6 month after FUS ablation，there are new blood vessels formation in the coagulation necrosis area of rats 'pancreas and it is associated with the expression of Tie-2.

Angiogenesis；Ultrasound，focused；Pancreas；Rat，Sprague-Dawley

R361.2；R445.1

A

1672-8475（2016）08-0495-05

10.13929/j.1672-8475.2016.08.011

敖澜（1990—），女（满族），黑龙江佳木斯人，在读硕士。研究方向：聚焦超声治疗胰腺癌。E-mail：m15213340965_1@163.com

方廖琼，西南大学生物技术学院，400716；重庆医科大学生物医学工程学院省部共建超声医学工程国家重点实验室超声医学工程重庆市市级重点实验室，400016。E-mail：lqfang06@163.com

2015-12-06

2016-01-04