鸡I型IFN及TLR-3和TLR-7实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

曹志伟,孙忠晟,郭学金,王建琳,尹燕博

(1.青岛农业大学动物科技学院,山东青岛266109;2.青岛澳兰百特生物工程有限公司,山东青岛266101)

鸡I型IFN及TLR-3和TLR-7实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

曹志伟1,孙忠晟2,郭学金1,王建琳1,尹燕博1

(1.青岛农业大学动物科技学院,山东青岛266109;2.青岛澳兰百特生物工程有限公司,山东青岛266101)

为检测鸡抗病毒相关基因在病毒感染过程中的动态变化规律,研究建立了鸡IFN-α、IFN-β、TLR-3和TLR-7的实时荧光定量RT-PCR的检测方法.根据GenBank提供的鸡IFN-α、IFN-β、TLR-3和TLR-7参考序列设计了相应的特异引物,用常规RT-PCR方法从鸡脾脏总RNA中扩增得到鸡相应基因.将其cDNA分别克隆到pMD19-T载体中进行测序鉴定,采用SYBR Green I染料法,建立标准曲线并分析其溶解曲线.结果表明,这4种基因的检测灵敏度可高达46 copies/μL,且具有良好的特异性和重复性.此检测方法的建立为动态定量检测及研究鸡IFN-α、IFN-β、TLR-3和TLR-7基因的表达变化提供了有效的手段.

IFN-α;IFN-β;TLR-3;TLR-7;实时荧光定量PCR

Corresponding authors:WANG Jian-lin;YIN Yan-bo

I型干扰素(Interferon,IFN)包括IFN-α和IFN-β,是机体抗病毒防御的重要组成,不仅可以通过细胞表面受体作用可使细胞产生抗病毒蛋白,同时还可增强NK细胞、巨噬细胞和T淋巴细胞的活力,被视为机体的免疫指示器[1-2].I型IFN的合成和表达是通过机体的模式识别受体的活化来完成的,其中TLR是关注较多的模式识别受体.鸡的10个TLR中,和天然免疫相关的主要有TLR-3,TLR-7和TLR-15,而研究较多的为TLR-3和TLR-7[3],分别识别双链RNA和单链RNA,二者被活化后可表达一些天然抗病毒因子,如I型IFN和促炎性细胞因子,发挥机体抗病毒天然免疫[4].

TLR-3和TLR-7可活化表达I型IFN等抗病毒因子,共同完成机体的抗病毒天然免疫反应,这是目前动物病毒性疾病研究的重要内容.故本研究拟建立一种用于检测鸡IFN-α、IFN-β、TLR-3和TLR-7分子mRNA的SYBR Green I实时荧光定量RT-PCR方法,为病毒感染后这些相关基因的定量检测提供方法.

1　材料与方法

1.1主要仪器及材料TRIZol试剂、反转录酶、RNA酶抑制剂、Taq酶、pMD19-T,购自宝生物工程(大连)有限公司;Fast Start Universal SYBR Green Master,购自青岛赛尚科贸有限公司;荧光PCR仪为杭州博日科技有限公司生产.

1.2引物的设计及合成根据GenBank上鸡相关基因的序列及文献设计各自的特异引物,由北京六合华大基因科技股份有限公司合成(见表1).

1.3总RNA的提取及cDNA的合成使用TRIZol-氯仿-异丙醇法提取总RNA,按常规反转录体系进行反转录,反转录的cDNA-20℃保存.

1.4标准曲线的建立

1.4.1普通PCR扩增常规PCR反应体系进行PCR扩增.反应条件:94℃5 min;94℃30 s、55℃40 s、72℃90 s,30个循环;72℃10 min;最后4℃结束反应.

1.4.2质粒标准品制备PCR产物电泳,试剂盒回收目的条带,连入pMD19-T载体中,经PCR和测序鉴定的阳性重组质粒进行纯度测定,并用紫外分光光度计测其260 nm OD值,计算其拷贝数. 1.4.3建立定量标准曲线质粒倍比稀释后进行SYBR Green I RT-PCR扩增.50 μL反应体系包括:SYBR Green Master(ROX)、上下游引物、模版.扩增参数:50℃2 min;95℃10 min;95℃15 s、60℃60 s,40个循环.经荧光定量RT-PCR检测后,计算Ct值,取4～6个点绘制标准曲线.

1.5特异性用此方法检测TNF-α、IL-1、新城疫病毒(NDV)、H9N2亚型禽流感病毒(H9N2 AIV)进行特异性验证,同时设阴性和阳性对照.

1.6重复性试验取3份不同的脾脏样品,分别提取RNA进行实时荧光定量PCR.每份脾脏样品分别作3次组内重复和组间重复性试验,对检测结果进行统计学分析.

1.7敏感性试验用1X101～1X1010copies/μL之间不同拷贝数的阳性重组质粒分别做实时荧光定量PCR.

2　结果

2.1PCR产物的琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物凝胶电泳结果表明,扩增的IFN-α、IFN-β、TLR-3和TLR-7的大小与预期相符(见图1).

图1　IFN-α、IFN-β、TLR-3和TLR-7的PCR产物凝胶电泳图

2.2重组质粒的筛选将重组质粒转化入大肠杆菌DH5α内,进行蓝白斑筛选,对经菌落PCR确认的阳性克隆菌进行扩大培养,提取质粒DNA, PCR进一步确认阳性重组子.

2.3定量标准曲线的绘制

2.3.1阳性模版浓度IFN-α、IFN-β、TLR-3和TLR-7阳性质粒模版150倍稀释后,用紫外分光光度计测其260 nm OD值分别为:0.148、0.173、0.203、0.195;质粒DNA浓度分别为:1 110、1 297.5、1 522.5、1 462.5 μg/μL;质粒拷贝浓度分别为:3.5X1011、4.1X1011、4.6X1011、4.5X1011copies/μL.

2.3.2标准曲线绘制对质粒10倍连续稀释液进行实时荧光定量PCR检测,采用样点拟合法,得出各细胞因子的动力学扩增曲线和标准曲线方程(见图2).

2.4线性关系、扩增效率确认根据上图标准曲线可知,相关系数(R2)均大于0.98,结果可信度较高;标准曲线斜率均在-3～-3.5之间;PCR扩增效率(E)均在0.9～1.2之间,达到绝对定量实验要求.

表2　重复性试验结果

图2　A、B、C、D分别为IFN-α、IFN-β、TLR-3和TLR-7动力学扩增曲线和标准曲线方程

2.5重复性试验结果经计算,Ct值的变异系数(CV)值均在5%以内(见表2),表明该方法重复性良好.

2.6敏感性试验检测样品在实时荧光定量PCR 40个循环内的Ct>0,则结果判为阳性.用建立的方法检测10倍梯度稀释的IFN-α、IFN-β、TLR-3和TLR-7基因标准重组质粒,最小检出模板浓度为101copies/μL.

2.7产物溶解曲线分析检测样品的溶解曲线均出现单峰,未见引物二聚体和其他非特异性扩增片段的曲线峰,且产物溶解温度相同.

2.8特异性分析结果TNF-α、IL-1、NDV、H9N2 AIV均无特异性峰出现,无引物二聚体及非特异性扩增产物出现.

3　讨论

研究认为,鸡TLR-3可识别双链RNA,然后快速诱导I型IFN的表达,且TLR-3与IFN-α和IFN-β在鸡淋巴细胞和成纤维细胞系(DF-1)中以剂量依赖性的方式上调[5].TLR-7激动剂可诱导鸡脾细胞中IFN-α和IFN-β的表达[6].SPF鸡感染NDV、IBDV毒株后,TLR-3 mRNA和TLR-7 mRNA的表达水平明显升高,且IFN-α和IFN-β的表达也明显上调[7].这表明鸡TLR-3、TLR-7和I型IFN的表达密切相关,是鸡抗病毒天然免疫方面的重要指标.

PCR反应中的SYBR Green I荧光染料被激发出荧光信号,可用来积累实时监测整个PCR反应进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析[8-9].由于荧光阈值Ct与PCR体系中起始模板量的对数值之间有着严格的线性关系,故可用阳性梯度标准品的Ct制成标准曲线,再根据样品的Ct,可以准确定量出目的基因起始模板的拷贝数.由本实验定量标准曲线可以看出,不同梯度IFN-α、IFN-β、TLR-3和TLR-7阳性克隆标准品拷贝数的对数值与Ct之间有较好的线性相关关系.

本试验过程中所构建的IFN-α、IFN-β、TLR-3和TLR-7质粒测序结果表明,扩增结果为预期目的序列.实时荧光定量PCR熔解曲线只有一

个特异性单峰,TNF-α、IL-1、NDV、H9N2 AIV均无特异性峰出现,且无引物二聚体及非特异性扩增产物出现,说明扩增特异性很强.所建立的检测方法中,4种细胞因子的CV值均在5%以内,表明这4种检测方法重复性良好;用所建立的方法检测10倍梯度稀释的IFN-α、IFN-β、TLR-3和TLR-7基因标准重组质粒,最小检出模板浓度为101copies/μL,表明这4种检测方法的灵敏度高.故本研究方法克服了SYBR Green I荧光定量RT-PCR的易产生非特异信号和对引物设计要求高的特点.

综上所述,本研究建立的方法,可以灵敏、特异、便捷地对鸡IFN-α、IFN-β、TLR-3和TLR-7在mRNA水平进行定量检测,该方法的建立对鸡抗病毒天然免疫相关研究具有重要意义.

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Development of real-time quantitative PCR for chicken IFN type I,TLR-3 and TLR-7

CAO Zhi-wei1,SUN Zhong-cheng2,GUO Xue-jin1,WANG Jian-lin1,YIN Yan-bo1
(1.College of Animal science and Veterinary Medicine,Qingdao Agricultural University,Qingdao 266109,China; 2.Qingdao OLand-better Bioengineering Company,Qingdao 266101,China)

To study the dynam ic variety of chicken genes correlated with the innate immunity after infected with viruses,the real-time quantitative RT-PCR for IFN-α,IFN-β,TLR-3,and TLR-7 was developed in the study.Four pairs of primers were designed for these cytokines according to the gene sequences available in GenBank,and these four genes were amplified from total RNA from the in chicken sp leen.Then the cDNA of these four genes were cloned into the pMD19-T vector which are used as the standards after sequencing,and standard curve was established and melting curve was analyzed.The results showed that the meth⁃od with high detection sensitive,good specificity and repeatability.The results suggested that real-time quantitative RT-PCR de⁃veloped in the study will provide an efficient method for the quantitative analysis of chicken IFN-α,IFN-β,TLR-3,and TLR-7gene expression.

IFN-α;IFN-β;TLR-3;TLR-7;real-time quantitative RT-PCR

R 446.1

A

0529-6005(2016)02-0025-03

2014-07-02

国家自然科学基金项目(31272535);山东省现代农业产业技术体系家禽创新团队建设项目(SDAIT-13-011-03);山东省自然科学基金(ZR2013CL022)

曹志伟(1989-),男,硕士生,从事预防兽医学研究,E-mail:czwhehehe@163.com

王建琳,E-mail:bjsxxw@126.com;尹燕博,E-mail: yanboyin2011@163.com