梅毒螺旋体抗体在诊断新生儿梅毒中的应用和讨论

褚雪莲　严丽英

[摘要]目的：探讨梅毒螺旋体（treponema pallidum，TP）抗体在诊断新生儿梅毒中的应用。方法：分别用甲苯胺红不加热血清试验（TRUST）、TP-ELISA和密螺旋体颗粒凝集实验（TPPA）法对84例确诊新生儿梅毒患者与100例健康新生儿血清进行检测。结果：三种检测梅毒螺旋体抗体方法的灵敏度分别为51.2%、98.8%和100%，相对而言，TRUST法不适合作为诊断新生儿梅毒的初筛试验。结论：TP-ELISA法灵敏度与特异性相对较高，操作简便易行，建议作为诊断新生儿梅毒的初筛试验；TPPA法由于操作繁琐复杂，可结合临床作为新生儿梅毒的确诊试验。

[关键词]梅毒螺旋体抗体；新生儿梅毒；甲苯胺红不加热血清试验；双抗原夹心酶联免疫吸附试验；密螺旋体颗粒凝集实验

[中图分类号]R759.1 [文献标志码]A

苍白密螺旋体（treponema pallidum，TP）苍白亚种，又称梅毒螺旋体，是性传播疾病梅毒的病原体。人类是梅毒螺旋体的唯一传染源，性接触直接传染是最主要的传播途径，但患梅毒的孕妇可经胎盘感染胎儿，多发生于妊娠4个月之后。通过胎盘梅毒螺旋体进入胎儿血流，经血流扩散至全身，发生全身性感染，并在肝、脾、肾上腺等处大量生长繁殖，致流产、早产或死胎的发生。而晚期感染成活的胎儿患有先天性梅毒（congenitalsyphilis，CS），常出现特殊体征如马鞍鼻、间质性角膜炎、先天性耳聋、锯齿形牙等。妊娠期梅毒常无明显症状，为潜伏梅毒，而新生儿先天性梅毒易误诊漏诊，使新生儿身体造成不可逆转的伤害。为了控制与避免梅毒螺旋体感染对新生儿造成巨大危害，控制先天性梅毒的发病率，规范、严格的产前梅毒筛查和先天性梅毒的早期诊断则显得尤为重要。临床症状和梅毒血清学检测是目前临床上对新生儿梅毒进行诊断的主要标准。新生儿先天梅毒有多种临床表现，症状体征缺乏特异性，并可造成多脏器累及。另外，发生漏诊或者误诊，往往是由于父母不知情，或者故意隐瞒梅毒病史。梅毒螺旋体侵入人体后刺激人体产生两类抗体，分别为宿主对螺旋体表面的脂质做出应答产生的非特异性抗类脂抗原抗体，与B细胞产生的IgM、IgG两种特异性梅毒螺旋体抗体。梅毒血清学检测根据使用抗原不同，分非特异性类脂质抗原检测与特异性密螺旋体抗原检测两大类，非特异性脂质抗原检测主要用于对梅毒的初步筛查，包括不加热血清反应素（USR）、快速血浆反应素（RPR）及甲苯胺红不加热血清试验（TRUST）等；特异性密螺旋体抗原检测使用的抗原是梅毒螺旋体的特异成分，主要包括荧光密螺旋体抗体吸收（FTA-ABS）、密螺旋体颗粒凝集实验（TPPA）和胶体金法，这些方法常用于确诊梅毒感染。由于母体IgM抗体不能通过胎盘，而胎儿B细胞只能产生IgM，出生3个月后才能合成IgG，故TP-IgM抗体检测是新生儿先天性梅毒早期诊断最理想的方法。本研究对比讨论了不同梅毒螺旋体抗体检测方法在诊断新生儿梅毒中的特点与临床应用。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择本院新生儿科2006年4月至2014年5月确诊梅毒的新生儿84例及新生儿母亲84例作为研究对象。病例纳入标准：（1）经实验室、病理学检查确诊为梅毒患者，符合《2015美国疾病控制中心性传播疾病（梅毒）治疗指南》；（2）患者可出现硬下疳、多形性皮损等临床表现：（3）患者签署知情同意书，自愿参与研究。排除标准：（1）合并心、肝、肾等其他器官严重器质性病变患者：（2）意识不清及精神疾病患者。其中确诊为梅毒新生儿年龄1h～14d；男44例，女40例。同时选择我院健康新生儿100例作为对照。患儿年龄为1h～6d。均采集空腹静脉血（无溶血、脂血）2 3mL，离心分离血清-20℃保存待检。

1.2 方法

1.2.1 仪器与试剂 TRUST试剂盒（上海荣盛生物科技有限公司，生产批号：140123），TP-ELISA试剂盒（厦门英科新创科技有限公司，生产批号：140319），TPPA试剂（日本富士瑞必欧株式会社珠海丽珠有限公司，生产批号：VN40628）。

1.2.2 TRUST试验 该试验以包被有心磷脂的胆固醇做为载体，与血清中的非特异性抗体发生抗原抗体反应，形成胶体微粒。血清中的抗体，与混悬于甲苯胶红溶液中的抗原微粒反映出现肉眼可见的粉红凝集块即判断为阳性。按试剂盒说明书要求，按1：2、1：4、1：8、1：16、1：32对待测血清进行倍比稀释，观察呈现阳性反应的最高稀释度报告梅毒血清TRUST滴度。

1.2.3 TP-ELISA法检测 该检测方法使用超声波击碎的Nichol株为抗原，用双抗原夹心ELISA法，来检测TP抗体是否存在于待测血清中。将高纯度TP特异抗原包被于微孔反应板中，加入标本血清和酶标的高纯度TP抗原，形成TP抗原-TP抗体一酶标TP抗原夹心复合物。利用酶底物/色原液（过氧化脲/TMB）产生显色反应，显色强度与TP抗体水平成正比。试验操作依据试剂说明书要求，然后酶标仪波长450nm，空白孔调零，测定OD值，OD值/cutoff值≥1判定为阳性，OD值/cutoff值<1则判定为阴性，临界值=阴性对照OD均值×2.8。

1.2.4 TPPA法检测 该试验是用明胶颗粒包被梅毒螺旋体Nichols株的精致菌体成分制成的致敏颗粒来检测TP抗体，当样本中的TP抗体与该颗粒结合时可发生凝集，不管是均一颗粒凝集或是较大的环状凝集均可判断为阳性。当孔底形成小环状凝集，但外周边缘光滑、完整时判断可疑。颗粒在孔底聚集成纽扣状且边缘光滑，则判断为阴性结果。试验操作依说明书，在室温条件下，用稀释液将血清样本分别在u形板上稀释，并加入致敏颗粒或未致敏颗粒，静置2h，观察结果，加致敏粒子孔大于或等于1：80为阳性。

1.3 诊断方法

参照卫生部2007年颁布的中华人民共和国卫生行业标准WS273-2007《梅毒诊断标准》做为胎传梅毒的诊断标准。其中，实验室检查非特异性类脂质抗原试验与特异性密螺旋体抗原试验呈双阳是诊断标准之一。endprint

1.4 统计学分析

采用SPSS19.0统计分析软件进行分析，计数资料用，检验，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 母亲与新生儿梅毒螺旋体抗体检测方法比较

所有梅毒产妇标本三种检测结果均为阳性。新生儿TRUST检测阳性检出率为51.2%，与母亲的差异有统计学意义（x²=54.24，P<0.05）。新生儿TP-ELISA检测阳性83例，阳性检出率达98.8%，与母亲对比差异无统计学意义（x²=1.01，P>0.05）。TPPA检出新生儿阳性84例，阳性检出率为100%，与母亲对比差异无统计学意义，见表1。

3 讨论

梅毒螺旋体抗原成分分为梅毒螺旋体膜蛋白抗原和内鞭毛蛋白抗原两种，膜蛋白抗原包括心磷脂抗原和类脂抗原，内鞭毛蛋白抗原包括特异性不耐热抗原与特异性耐热的多糖抗原（多糖-RNA复合物），可刺激机体产生类脂质抗原的非特异性反应素和抗梅毒螺旋体抗原特异性抗体。根据检测所用抗原的不同，检测患者血清中非密螺旋体抗原血清试验和梅毒螺旋体抗原血清实验是临床诊断梅毒的实验室检查两种方法。TRUST作为非梅毒螺旋体抗原试验的代表，其灵敏度与特异性均低于以FTA-ABS、TPPA为代表的梅毒螺旋体特异性抗原检测，但其在对梅毒感染的初筛以及观察疗效、随访和复发的辅助诊断中有重要价值。

新生儿先天性梅毒又称胎传梅毒，梅毒螺旋体经由母体胎盘传给胎儿，可能由在孕前或在妊娠期间感染梅毒，且未经治愈的产妇传播。梅毒产妇垂直传播的概率接近100%。梅毒孕妇及随之而来的先天性梅毒，现在主要出现在许多发展中国家。先天性梅毒主要是缺乏产前护理（antenatal care，ANC）和性传播感染控制的后果。根据国外研究调查，在瑞士，相对于国际准则，在妊娠期间梅毒筛查一般不建议使用，但因此在瑞士人口中2006年到2009年间感染梅毒的育龄妇女病例大幅增加。在匈牙利，在怀孕的前三个月，在产前检查中梅毒的筛选检查是强制性的，以防止梅毒的发展。在我国，先天性梅毒已对新生儿健康造成了严重影响，为保障优生优育，保障我国人口出生质量与健康，及早的诊断、干预和治疗是基础。作为临床实验诊断科室，应当联系应用不同的检测方法，使检验结果的灵敏度与特异性相结合，因此正确地选择与评价实验室现用检测方法对新生儿梅毒诊断的初筛具有重要意义。

TRUST试验主要用于Ⅰ、Ⅱ期梅毒的定性筛查，这种非梅毒螺旋体抗体试验的缺陷主要包括在初级和晚期梅毒检测灵敏度的低下，和可能存在的前带反应或假阳性结果。前带反应一般在Ⅱ期梅毒患者中有1%～2%的发生率，是由于当抗体过量时阻碍了正常抗体-抗原反应。有研究表明TRUST亦可做为半定量试验观察，其滴度的变化可以很好的反映梅毒患者的预后，对梅毒患者的疗效观察有重要意义。梅毒螺旋体特异性抗体检测，例如ELISA或者TPPA较TRUST要更加昂贵，用于在一定程度上会加重患者的负担，但是可以反映患者是否曾经感染和其治疗情况。因此美国疾病控制和预防中心（CDC）与Binnicker等建议使用反向梅毒筛查算法，即自动化梅毒螺旋体抗体检测（如ELISA）。

人体感染梅毒螺旋体后，IgM抗体产生先于IgG与IgA抗体，因此IgM抗体检测可应用于梅毒的早期诊断。先天性梅毒新生儿出生早期常缺乏临床症状和体征，同时难以获取暗视野显微镜检查所需标本。由于小分子的IgG可通过孕妇的胎盘屏障，而较大的IgM一般不能够通过胎盘，无法进入胎儿的血液循环中，所以只有在新生儿血清中检测到特异性IgM抗体时，说明胎儿受到了宫内感染，自身产生了梅毒特异性抗体。所以，新生儿梅毒的检测，采用免疫印迹法（Western-blot法）检测抗梅毒螺旋体IgM抗体，可获得高特异性与高敏感性的结果，是判断结果准确的方法，但该方法操作复杂费时，临床上常不使用。

本研究中，我们可以看到，TRUST试验由于是非特异性心磷脂抗体检查，相对炅敏度与特异性较低（51.2%与92.0%），且新生儿血清TRUST滴度与其母亲的血清滴度相比较，新生儿的滴度普遍比母亲要低，但若新生儿的滴度高于母亲的4倍，应当高度怀疑先天性梅毒的存在。TP-ELISA试验具有较高的灵敏度与特异性（98.8%与98.0%），并且由于其酶放大效应，可使ELISA的敏感性甚至高于TPPA法，本次研究由于样本量较小，并没有在结果中体现出来，而且ELISA易于自动化、标准化，操作简单快捷，但可因抗体滴度过高而出现假阴性，因此临床高度怀疑是新生儿梅毒时需用TPPA作确诊试验。TPPA也具有很高的灵敏度与特异性（100%与100%），但由于其操作繁琐复杂，可应用于新生儿梅毒的确诊。一般在初筛试验中，应尽量提高其灵敏度，因此初筛建议使用TP-ELISA作为新生儿梅毒螺旋体抗体初筛试验，而不是TRUST试验。

综上所述，TRUST适用于对梅毒感染治疗效果进行动态监测，梅毒螺旋体特异性抗体检测（ELISA、TPPA等）在待测血清除去了交叉抗体，提高了特异性，因此可作为确证试验，对潜伏期和晚期梅毒敏感性更高。不能单凭梅毒的血清学试验阳性作为诊断新生儿梅毒的绝对依据，它只提示标本中存在类脂抗体或TP抗体，同时也不能因为实验室检查的阴形结果排除梅毒螺旋体的感染，检测结果应结合临床综合分析。

（收稿日期：2015-09-18）endprint