齐墩果酸联合二甲亚砜对生物膜中粪肠球菌抑菌作用研究*

吴悠胡焱王瑶

齐墩果酸联合二甲亚砜对生物膜中粪肠球菌抑菌作用研究*

吴悠①胡焱①王瑶②

目的：研究齐墩果酸联合二甲亚砜对单一生物膜中粪肠球菌的抑菌效果。方法：（1）采用微量棋盘液体稀释法测定齐墩果酸与二甲亚砜联合抑菌浓度分数指数（FICI）。（2）建立24 h粪肠球菌生物膜模型，随机分为三组：1 mg/mL齐墩果酸+50%二甲亚砜（A组）、2%氯己定（B组）、去离子水（C组）。各组药物分别作用30 min后荧光染色，激光共聚焦显微镜（CLSM）观察染色情况及死、活菌数量变化。结果：（1）二甲亚砜和齐墩果酸对粪肠球菌的MIC分别20%和100 μg/mL。联合时FICI=0.5125。（2）A组、B组生物膜中以死菌为主，仅见散在零星分布活菌，C组生物膜中以活菌为主，仅存在极少量死菌。结论：齐墩果酸与二甲亚砜联合，对体外粪肠球菌的抗菌作用表现为相加作用，1 mg/mL齐墩果酸联合50%二甲亚砜可有效抑制生物膜中粪肠球菌生长。

齐墩果酸； 二甲亚砜； 粪肠球菌； 激光共聚焦显微镜

First-author's address：Southwest Medical University，Luzhou 646000，China

粪肠球菌（Enterococcus faecalis，E.faecalis）具有超强的生存能力，在根管内形成生物膜后，粪肠球菌可明显增强抗力近1000倍，引起根管治疗后再感染，或导致难治性根尖周炎的迁移不愈［1-4］。粪肠球菌耐药性强，目前常用的根管消毒药物对于抑制根管内粪肠球菌生长的有效性、安全性尚不能达到较为理想的效果［5］。齐墩果酸（Oleanolic Acid，OA）是五环三萜类化合物，普遍存在于多种天然植物中，毒性极低且具有良好的抑菌作用［6］。大量研究发现，OA能够抑制多种口腔病原菌的生长，其中包括粪肠球菌。二甲亚砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO）是研究OA常用的赋形剂，其对生物膜的渗透作用好，且其本身也具有抗菌作用［7-10］。但以往在研究OA抑菌性能时并未考虑DMSO抗菌作用对其可能存在的影响。本研究将OA溶于DMSO，采用微量棋盘稀释法、荧光染色激光共聚焦显微镜观察研究两种药物联合抑制浮游态粪肠球菌时的联合药敏效果，以弥补以往研究的不足之处；并研究其抑制单一生物膜中的粪肠球菌生长的有效性，探讨其用于粪肠球菌感染根管治疗的可能性。

1　材料与方法

1.1材料 粪肠球菌标准菌株ATC29212（四川大学华西口腔医学中心实验室）；齐墩果酸（OA）分析纯（绵阳东方源生物科技有限公司）；2%醋酸氯己定（Chlorhexidine，CHX）（上海麦克林生化科技有限公司）；二甲亚砜（DMSO）分析纯（北京索莱宝科技有限公司）；吖啶橙（Acridine orange，AO）（Sigma，美国）；溴化乙锭（Ethidium bromide，EB）（Sigma，美国）；麦氏比浊仪（Biomerieux SA，法国）；高压蒸汽灭菌消毒器（松下健康医疗器械株式会社，日本）；YQX-II厌氧培养箱（上海跃进医疗器械有限公司）；激光扫描共聚焦显微镜（Confocal laser scanning microscope，CLSM）（Leica SP8，德国）。荧光染色液：避光条件下，AO、EB各1mg分别溶于10 mL蒸馏水中混匀，配制成为100 μg/ mL的储备液，4 ℃避光储存。使用时，1∶1混匀后1∶20稀释，配制成工作液。

1.2药敏实验

1.2.1菌株的复苏活化 冻存管中粪肠球菌经两次传代后，细菌进入茁壮期。比浊仪调整菌液浓度至1.5×108CFU/mL，1∶100生理盐水稀释至1.5×106CFU/mL。

1.2.2测定DMSO、OA最小抑菌浓度值（MIC） 分别采用液体倍比稀释法和琼脂稀释法测定DMSO 和OA的MIC值。最终DMSO浓度为80%、60%、40%、20%、10%、5%、2.5%，OA终浓度（μg/mL）为250、200、150、100、50、10。取100 μL菌悬液即刻接种摇匀，37 ℃厌氧条件下孵育培养48 h。实验重复3次。培养结束后肉眼观察结果，无细菌生长或菌落生长被完全抑制的最低药物浓度即为DMSO或OA的MIC。

1.2.3微量棋盘稀释法 无菌96孔板中OA横排加入，DMSO纵排加入。OA的终浓度（μg/mL）分别为 200、150、100、50、10、5、2.5、1.25，DMSO的终浓度分别为30%、25%、20%、15%、10%、5%。OA和DMSO按照浓度由高到低分别加入各孔100 μL。各孔加入菌悬液100 μL。第9列为阴性对照，A-F行每孔加入100 μL BHI培养基+100 μL菌悬液。37 ℃厌氧培养48 h后，观察结果。实验重复3次。

1.2.4联合用药效果评价 根据联合药敏管与单独药敏管的抑菌情况，计算抑菌浓度分数指数（FICI）。FICI=甲药联合时MIC/甲药单独时MIC+乙药联合时MIC/乙药单独时MIC。当FICI≤0.5时为协同作用，0.5＜FICI≤1时为相加作用，1＜FICI≤2时为无关作用，FICI＞2时为拮抗作用。

1.3对粪肠球菌生物膜的作用

1.3.1粪肠球菌生物膜模型的建立 将20 mm×20 mm灭菌盖玻片共12个放入6孔板，滴加500 μL菌悬液，37 ℃厌氧条件下静置30 min，使细菌黏附于盖玻片表面。30 min后，贴壁加入5mL BHI培养液，厌氧培养24 h，形成粪肠球菌生物膜。

1.3.2不同药物处理粪肠球菌生物膜 吸净培养液，用1 mL PBS缓冲液轻轻洗涤盖玻片各3次，每次1 min，以除去盖玻片表面浮游细菌。样本随机分为三组，每组4个：1 mg/mL OA+50%DMSO （A组）、2%CHX（B组）、去离子水（C组）。分别浸入预热至37 ℃的各组药液中，静置30 min后吸净药液，再次用1 mL PBS轻轻洗涤盖玻片3次，每次1 min。

1.3.3激光共聚焦显微镜观察 避光条件下于生物膜表面滴加200 μL荧光染色液，暗室静置孵育15 min，再用500 μL PBS缓冲液洗涤3次，每次1 min。观察条件：AO最大激发波长405 nm，最大发射波长585 nm；EB最大激发波长488 nm，最大发射波长610 nm。各生物膜样本由生物膜内层向外层逐层扫描，步距2 μm。采集粪肠球菌生物膜中间层图像。

2　结果

2.1联合药敏实验结果 DMSO对粪肠球菌的MIC值为20%，OA对粪肠球菌的MIC值为100 μg/mL。采用微量棋盘稀释法测得在联合应用时MICDMSO=10%，MICOA=1.25 μg/mL。FICI=10/20+1.25/100=0.5125＞0.5，表明OA与DMSO联合对粪肠球菌的联合药敏表现为相加作用。

2.2CLSM观察结果 通过CLSM观察，可见粪肠球菌生物膜具有一定的厚度。不同状态的细菌呈现荧光颜色有差异：图中白色为活菌发出的荧光，灰色即死菌发出的荧光。A组、B组生物膜叠加图像细菌以灰色为主，有少量零星分布的白色细菌（活菌），且B组白色略少于A组（图1～6），说明A、B组中粪肠球菌生物膜绝大部分由死菌构成，仅少量活菌散在存在。C组生物膜叠加图像呈现白色，图中菌体几乎全部为白色，仅可见极少量灰色（图7～9），说明空白对照组中粪肠球菌生物膜几乎全由活菌构成。

图1　A组叠加

图2　A组活菌

图3　A组死菌

图4　B组叠加

图5 B组活菌

图6　B组死菌

图7　C组叠加

图8　C组活菌

图9　C组死菌

3　讨论

目前用于根管消毒的药物主要包括氢氧化钙、氯已定、酚醛类等。氢氧化钙是根管消毒常用和首选药物［11］。其可通过解离出大量羟基离子发挥其抗菌作用，但对于感染根管中的粪肠球菌缺乏足够的抗菌能力［12］。此外，氢氧化钙还具有一定的毒副作用。氯已定对多数细菌均具有抑菌效果，对于感染根管中的粪肠球菌的抗菌作用明显［13］。但同时氯己定对根尖周的组织修复也有一定的负面影响：能够影响蛋白质合成，降低细胞增殖、细胞迁移和长期生存能力，对成纤维细胞、成骨细胞等均有一定毒性［14］。甲醛甲酚、樟脑酚也曾用于根管消毒，但因其均具有一定的细胞毒性、刺激性和半抗原性，因此临床应用已逐渐将其淘汰［15］。由此，亟需寻找一种更加安全，且能够更加有效地抑制根管内粪肠球菌生长的药物，以期提高根管治疗、再治疗的成功率。

齐墩果酸（Oleanolic Acid，OA）作为一种纯天然药物，能够从1620多种植物分离出来［16］。在我国，OA主要用于减轻急慢性肝炎患者肝脏的损伤，是临床上治疗急性黄胆型肝炎和慢性病毒性肝炎较为理想的药物。随着其药理作用研究的不断深入，OA在口腔疾病治疗方面应用也逐步发现。Scalon等［10］从三萜烯酸及其衍生物的构效关系分析，通过在OA不同位点上增加羟基、羧基基团产生多种衍生物，溶于10%DMSO后测定其对多种口腔病原菌（包括粪肠球菌）的MIC值，证明了三萜酸结构上C-3位点上的羟基和C-17位点上的羧基是OA针对口腔病原体具有抗菌活性的重要基团。因此，本研究选择OA作为潜在的理想根管消毒药物，原因在于：（1）OA是纯天然提取物，来源广泛，易于获得且对机体安全无毒；（2）既往研究表明，OA对多种口腔病原菌具有抑菌作用，因此可考虑将其用于根管消毒，特别是抑制造成根管内顽固性感染的粪肠球菌的生长；（3）OA临床上用于急慢性肝炎的辅助治疗，因此其可能是针对肝炎患者更为适合的根管消毒药物。

以往关于OA的抑菌实验均未考虑二甲亚砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO）对OA抑菌作用的影响，只是单纯地将DMSO作为OA的赋形剂，将OA直接溶于DMSO后，测定OA的抑菌作用［10，17］。本实验首次分别研究了DMSO和OA的抑菌效果及联合应用的抑菌效果，弥补了以往实验的不足之处。药敏研究证明，DMSO可以作为OA的赋形剂，增加其在根管内的渗透作用，有效抑制根管内粪肠球菌生长。有临床实验证实，50%的DMSO和2.5%的双氯芬酸联合可明显减轻根尖周炎疼痛、减少根管渗出，且患者对其耐受性良好，无一例出现副作用［18］。近年来美国FDA已批准将45.5%的DMSO作为双氯芬酸的赋形剂，治疗膝部骨关节炎［19］。选择OA浓度时主要考虑能有效抑菌且溶于DMSO未达饱和的较高浓度。因此后续实验将用50%的DMSO与1 mg/mL的OA联用。

激光共聚焦显微镜是目前观察细菌生物膜较为理想的手段。只有来自聚焦平面的激光可透过显微镜检测器前的小孔成像，且计算机可以通过对光信号逐点扫描后进行处理，因此显微镜的分辨率明显提高［20］。它可通过对细胞进行逐层“光学切片”，在不破坏细菌原有结构、最大限度保存生物膜结构的基础上，迅速、直观地获得光学横断面图像，可以有效避免扫描电镜观察前对样本进行脱水、干燥、固定、包埋等给细胞造成的损伤及对生物膜的破坏。由于其独特的成像原理，CLSM在细菌生物膜的研究中具有显著的优势。实验结果表明，1 mg/mL OA+50%DMSO与2%CHX处理粪肠球菌生物膜30 min后，均可有效破坏生物膜中绝大部分粪肠球菌活性。

综上所述，OA联合DMSO对体外粪肠球菌有相加的抑菌作用，1 mg/mL OA联合50%DMSO对生物膜中粪肠球菌的抑菌效果明显，可考虑作为再治疗根管、难治性根尖周炎根管的消毒药物。但其抗菌机制尚不完全明确，值得进一步研究。

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Study of Antibacterial Effect of Oleanolic Acid Combinating with Dimethyl Sulfoxide Against Enterococcus Faecalis in Biofilm

WU You，HU Yan，WANG Yao.//Medical Innovation of China，2016，13（14）：011-014

Objective：To evaluate the antibacterial effect of oleanolic acid（OA） and dimethyl sulfoxide （DMSO） against enterococcus faecalis （E.faecalis） in biofilm in vitro.Method：（1）The microscale checkerboard technique was applied to calculate the FICI value of OA combinating with DMSO.（2）E.faecalis biofilm models were formed after 24h. Samples were randomly divided into three groups：1 mg/mL OA+50% DMSO（group A），2% chlorhexidine（group B）， deionized water（group C）.Medicating in each groups for 30 min respectively. After fluorescent staining， samples were observed by CLSM.Result：（1）The MICs of DMSO and OA against E.faecalis were 20% and 100 μg/mL.FICI=0.5125 when they were combined.（2）The biofilms of group A and B were mainly composed of dead bacteria， only scattered living bacteria could be found.The biofilm of group C was mainly composed of living bacteria，only tiny dead bacteria could be detected. Conclusion：Additive joint action was existed between OA and DMSO against E.faecalis.1 mg/mL OA combinating with 50% DMSO can effectively remove the bacteria in biofilms.

Oleanolic acid； Dimethyl sulfoxide； Enterococcus faecalis； Confocal laser scanning microscope

2015年四川省教育厅科研计划项目（15ZA0170）；四川省科技厅-泸州市科技局-泸州医学院联合项目（LZLY-53）

①西南医科大学 四川 泸州 646000

②西南医科大学附属口腔医院

王瑶

10.3969/j.issn.1674-4985.2016.14.003

2016-01-18） （本文编辑：蔡元元）