测定微藻油脂方法的比较研究

张连水　张慧霞　齐树亭　张君　王海风　张洪志

摘要：以盐藻为材料，通过便捷性和准确性的比较对酸水解重量法、苏丹黑B染色法、尼罗红染色法进行系统研究。为结合酸水解重量法和尼罗红染色法作出染色藻种油脂含量的标准曲线，实现尼罗红染色法定量检测，同时对尼罗红染色法进行优化改进。

关键词：酸水解重量法；苏丹黑B染色法；尼罗红染色法；微藻油脂

不同种类微藻的油脂含量差别很大，油脂含量从1%到70%不等，甚至同一种类的不同品系之间也存在很大的差别。现在已知微藻有10 000余种，从中筛选出油脂含量高的微藻是一项繁重的工作，采用一种简便、快速、有效的微藻油脂提取方法无疑会事半功倍。目前，研究者常采用油脂提取方法有：酸热法、索氏提取法、超临界CO₂萃取法（SCF.CO₂法）和有机溶剂法，有报道利用这四种方法对真菌油脂进行提取，并对提取结果进行了比较，并得出对于微藻而言，尼罗红是最为简单、快捷测定油脂的方法。

本实验通过便捷性和准确性的比较，对酸水解重量法、苏丹黑B染色法、尼罗红染色法进行系统研究。为结合酸水解重量法和尼罗红染色法作出染色藻种油脂含量的标准曲线，实现尼罗红染色法定量检测，同时对尼罗红染色法进行优化改进。

1实验材料和方法

1.1实验材料

用于本实验的盐藻由海洋中心藻种实验室提供。藻种使用前进行超声波破壁处理。由于在之后苏丹黑B测定油脂含量、尼罗红测定油脂含量中均需要绘制油脂含量的标准曲线，所以此处藻种均进行冷冻处理，使其生长状态及油脂含量基本保持在恒定状态。

1.2实验方法

将实验用藻进行扩大培养，每天测定藻样620 nm处的吸光度，并且进行血球计数板法平行计数，绘制藻样吸光度值与细胞密度的关系图。分别用酸水解重量法、苏丹黑B染色法、尼罗红染色法对藻类进行油脂含量测定。

探究染色时间对染色后藻液细胞发射光谱的影响。取1.0 mg/mL的盐藻藻液（之前经过超声波破壁处理），加人尼罗红，使其最终质量浓度为1μg/mL，37℃水浴避光染色一段时间（1、3、6、9、12、15、18、20 min），480 nm激发光下，测量580nm处荧光强度。同时探究尼罗红质量浓度对藻液细胞发射光谱的影响，取8份1.0 mg/mL的盐藻藻液（之前经过超声波破壁处理），加入尼罗红，使其最终质量浓度为分别为0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4μg/mL，37℃水浴避光染色9min，480 nm激发光下，测量580 nm处荧光强度。

2实验结果与分析

2.1藻体吸光度值与细胞密度的关系

由图1标准曲线可以看出：盐藻的个体数与吸光度值基本呈正比，不同浓度的盐藻液与细胞密度之间的关系系数均较好。经回归分析，盐藻的细胞密度与光密度之间成直线关系，由于盐藻形状规则，光密度与细胞密度之间的相关性很好。将盐藻密度与吸光度值进行回归，回归方程为：y=0.013 9x-0.0055，R²=0.9792。

2.2酸水解法

对盐藻进行酸水解法提取油脂测得不同梯度油脂含量，由此数据生成标准曲线、回归方程和判别系数如图2。分析得到的判别系数：

R²=0.998 4，表明由两变量相关性得到的回归方程适配数据，具有高度的拟合优度。且ml=0.304，m2=0.301 5，相对误差为0.82%。

2.3藻体浓度与苏丹黑B染色后A645的标准曲线

由图3分析得到的判别系数R²=0.9925，表明由两变量相关性得到的回归方程适配数据，具有高度的拟合优度。

2.4苏丹黑B染色后A645与油脂含量的标准曲线

由图4可分析得到判别系数R³=0.949 4，表明由两变量相关性得到的回归方程适配数据，拟合优度一般。且由可行性验证可知ml=3.097、m2=3.015。相对误差为2.65%。

由此可以判定经苏丹黑B染色处理的微藻细胞对645 nm波长光具有最大吸收峰值。微藻油脂含量与经苏丹黑B染色处理后微藻细胞的吸光值A645呈一定程度的线性相关性，但存在一定误差。

2.5染色时间对藻液细胞发射光谱的影响曲线

由图5可知染色时间在8 min之前随着时间的延长相对荧光强度不断增大，之后在8～15min之内相对荧光强度基本无明显变化，15 min之后相对荧光强度明显下降且下降幅度较大。由此可知最佳染色时间在8～9 min。

2.6尼罗红质量浓度对藻液细胞发射光谱的影响曲线

由图6可知尼罗红终浓度在0.7μg/mL之前随着浓度的增加相对荧光强度不断增大，之后尼罗红浓度在O.7～1.2μg/mL之间相对荧光强度无明显变化。尼罗红浓度在1.2μg/mL之上时相对荧光强度缓慢下降，由此可知尼罗红的最佳终浓度为0.7～1.0μg/mL。

2.7三种方法的对比分析

综合实验方法和结论对比分析三种方法的优点和缺点，如表1。

3实验结论

酸水解称重法实验过程耗时较长，且需用到多种有机试剂具有毒性。但实验结果最为准确，且无论使用任何方法如需定量测定微藻内油脂含量的大小，在绘制标准曲线时均要用到此方法进行协助。苏丹黑B染色法较为简便，对实验药品实验器材要求较低，但测量结果并不十分准确，可以作为定性判断微藻油脂含量的方法。尼罗红染色法对药品仪器要求较高，但实验过程简便，且实验精度高。可以作为快速定性判断微藻油脂含量的方法，也可结合称重法作为同种藻种快速定量判断的方法。染色时间对相对荧光强度的影响：尼罗红染色法的最佳染色时间在8～9 min。尼罗红终浓度对相对荧光强度的影响：尼罗红染色法的尼罗红的最佳终浓度为0.7～1.0μg/mL。