HPLC法同时测定复方穿心莲片中4种成分的含量

詹十音（湖北省中西医结合医院药学部，武汉　430015）

HPLC法同时测定复方穿心莲片中4种成分的含量

詹十音＊（湖北省中西医结合医院药学部，武汉430015）

目的：建立同时测定复方穿心莲片中穿心莲内酯、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、脱水穿心莲内酯、山柰酚-3-O-葡萄糖苷含量的方法。方法：采用高效液相色谱法。色谱柱为Phenomenex C18，流动相为乙腈-0.1%磷酸（梯度洗脱），流速为1.0 ml/min，检测波长为225 nm（穿心莲内酯）、335 nm（槲皮素-3-O-葡萄糖苷）、254 nm（脱水穿心莲内酯和山柰酚-3-O-葡萄糖苷），柱温为25℃，进样量为10µl。结果：穿心莲内酯、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、脱水穿心莲内酯和山柰酚-3-O-葡萄糖苷的检测进样量线性范围分别为0.111～2.770、0.064～1.605、0.086～2.138、0.050～1.260µg（r均为0.999 9）；定量限分别为0.48、0.88、0.93、1.03 ng，检测限分别为0.79、1.15、0.96、1.07 ng；精密度、稳定性、重复性试验的RSD＜2.0%；加样回收率分别为96.57%～100.30%（RSD=1.3%，n=9）、95.04%～98.87%（RSD=1.3%，n=9）、95.74%～102.92%（RSD=2.4%，n=9）、96.73%～100.95%（RSD=1.6%，n=9）。结论：该方法简单灵敏、准确可靠、重复性好，可用于同时测定复方穿心莲片中穿心莲内酯、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、脱水穿心莲内酯、山柰酚-3-O-葡萄糖苷的含量。

高效液相色谱法；复方穿心莲片；穿心莲内酯；槲皮素-3-O-葡萄糖苷；脱水穿心莲内酯；山柰酚-3-O-葡萄糖苷

复方穿心莲片是由穿心莲和路边青提取制成的片剂，具有清热解毒、凉血、利湿之功效，可用于风热感冒、喉痹、痄腮、湿热泄泻等疾病的治疗［1］。穿心莲Andrographis paniculata （Burm.f.）Nees具有清热解毒、凉血、消肿的作用，其含有穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯、新穿心莲内酯等二萜内酯类成分［2-5］。路边青Geum aleppicum Jacq.具有益气健脾、补血养阴、润肺化痰的功效，含有槲皮素、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、5，7，4-三羟基黄酮、山柰酚-3-O-葡萄糖苷及山柰酚等黄酮类化合物［6-9］。复方穿心莲片收载于《卫生部药品标准中药成方制剂》（第十九册），该标准中除薄层鉴别外，其他均为常规检查项，无任何专属的定量检测方法［1］。现有相关文献采用薄层鉴别法进行定性鉴别或采用高效液相色谱（HPLC）法测定穿心莲内酯、脱水穿心莲内脂的含量［10-14］，上述检测方法的指标成分局限于穿心莲药材中的成分，未对处方中路边青药材的有效成分进行定量测定，因此不能全面地控制复方穿心莲片的质量。为了提高其质量控制标准，笔者采用高效液相色谱法（HPLC），建立了同时测定复方穿心莲片中穿心莲内酯、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、脱水穿心莲内酯、山柰酚-3-O-葡萄糖苷含量的方法。

1　材料

1.1仪器

1260型HPLC仪，包括G1311C型四元梯度泵、G1315D型二极管阵列检测器（DAD）、G1316A型柱温箱、G1329B型自动进样器、Chemstation Version B.04.02色谱工作站（美国Agilent公司）；KQ-500 DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司，功率：500 W，频率：40 kHz）；BP110s型万分之一电子天平（德国Sartorius公司）。

1.2药品与试剂

复方穿心莲片（白云山和记黄埔中药有限公司，批号：K5S010、K5S011、K5S012、K5S013、K5S0014，规格：0.37 g/片）；穿心莲内酯对照品（批号：110797-201412，纯度＞98.0%）、脱水穿心莲内酯对照品（批号：110854-201406，纯度＞98.0%）、槲皮素-3-O-葡萄糖苷对照品（批号：111809-201306，纯度＞98.0%）均购自中国食品药品检定研究院；山柰酚-3-O-葡萄糖苷对照品（南京替斯艾么中药研究所，批号：TCM010-150624，纯度＞98.0%）；乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为超纯水。

1.3药材

穿心莲药材（编号：S1）和路边青药材（编号：S2）均购于广东大翔药业有限公司，经湖北中医药大学陈科力教授鉴定为真品。

2　方法与结果

2.1色谱条件

色谱柱：Phenomenex C18（250 mm×4.6 mm，5µm）；流动相：乙腈（A）-0.1%磷酸（B），梯度洗脱（洗脱程序见表1）；流速：1.0 ml/min；检测波长：225 nm（穿心莲内酯）、335 nm（槲皮素-3-O-葡萄糖苷）、254 nm（脱水穿心莲内酯、山柰酚-3-O-葡萄糖苷）；柱温：25℃；进样量：10µl。

表1　梯度洗脱程序Tab 1　Gradient elution program

2.2溶液的制备

2.2.1混合对照品溶液取穿心莲内酯、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、脱水穿心莲内酯、山柰酚-3-O-葡萄糖苷对照品各适量，各分别置于25 ml量瓶中，加70%乙醇制成穿心莲内酯、山柰酚-3-O-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、脱水穿心莲内酯质量浓度分别为11.08、11.08、3.21、8.55 mg/ml的单一对照品贮备液。分别量取上述单一对照品贮备液适量，制成穿心莲内酯110.80µg/ml、槲皮素-3-O-葡萄糖苷64.20µg/ml、脱水穿心莲内酯85.50µg/ml、山柰酚-3-O-葡萄糖苷50.40µg/ml的混合对照品溶液。

2.2.2供试品溶液取样品10片，除去包衣，研细，取约0.5 g，精密称定，置于50 ml具塞锥形瓶中，加70%乙醇20 ml，超声提取30 min，提取2次，滤过，合并滤液，用70%乙醇定容，经0.45µm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.2.3阴性对照溶液按复方穿心莲片的处方比例和制备工艺，制备缺穿心莲、路边青的阴性样品，再按“2.2.2”项下方法制备阴性对照溶液，即得。

2.3系统适用性试验

取“2.2”项下混合对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液各适量，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱，详见图1。由图1可知，在该色谱条件下，穿心莲内酯、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、脱水穿心莲内酯、山柰酚-3-O-葡萄糖苷的色谱峰与其他峰均能达到基线分离，分离度＞1.5，理论板数以穿心莲内酯峰计为10 000，保留时间为28.5 min。结果表明，其他成分对测定无干扰。

2.4线性关系考察

精密称取“2.2.1”项下混合对照品溶液1、2、4、6、8、10µl，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以待测成分进样量（x，µg）为横坐标、峰面积（y）为纵坐标进行线性回归，得穿心莲内酯、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、脱水穿心莲内酯、山柰酚-3-O-葡萄糖苷的回归方程与线性范围，详见表2。

图1　高效液相色谱图A.混合对照品；B.供试品；C.缺路边青的阴性对照；D.缺穿心莲的阴性对照品；1.穿心莲内酯；2.槲皮素-3-O-葡萄糖苷；3.脱水穿心莲内酯；4.山柰酚-3-O-葡萄糖苷Fig 1　HPLC chromatogramsA.mixed reference substance；B.test sample；C.negative control without G.aleppicum；D.negative control without A.paniculata；1.andrographolide；2.quercetin-3-O-glucoside；3.dehydroandrographolide；4.kaempferol-3-O-glucoside

表2　回归方程与线性范围（n=6）Tab 2　Regression equations and linear ranges（n=6）

2.5定量限与检测限考察

取“2.2.1”项下混合对照品溶液适量，等倍逐步稀释，按“2.1”项下色谱条件连续进样测定6次，记录峰面积。当信噪比为10∶1时，得定量限（LOQ）；当信噪比为3∶1时，得检测限（LOD），详见表3。

表3　检测限与定量限测定结果Tab 3　Determination results of detection limit and quantitation limit

2.6精密度试验

精密吸取“2.2.1”项下混合对照品溶液10µl，按“2.1”项下色谱条件连续进样测定6次，记录峰面积。结果，穿心莲内酯、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、脱水穿心莲内酯、山柰酚-3-O-葡萄糖苷峰面积的RSD分别为1.4%、1.7%、0.82%、1.1%（n=6），表明仪器精密度良好。

2.7稳定性试验

取同一供试品溶液（批号：K5S010）适量，分别于室温下放置0、2、4、8、16、24 h时按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果，穿心莲内酯、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、脱水穿心莲内酯、山柰酚-3-O-葡萄糖苷峰面积的RSD分别为1.1%、1.6%，1.2%、0.86%（n=6），表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.8重复性试验

分别称取同一批样品（批号：K5S010）适量，共6份，按“2.2.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算穿心莲内酯、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、脱水穿心莲内酯、山柰酚-3-O-葡萄糖苷的含量，详见表4。由表4可知，本方法重复性良好。

表4　重复性试验结果（n=6）Tab 4　Results of reproducibility test（n=6）

2.9加样回收率试验

取已知含量的样品（批号：K5S010）粉末9份，每份约0.25 g，精密称定，分别置于50 ml具塞锥形瓶中，分别精密加入低、中、高质量的穿心莲内酯、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、脱水穿心莲内酯、山柰酚-3-O-葡萄糖苷对照品各适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算加样回收率，结果见表5。

表5　加样回收率试验结果（n=9）Tab 5　Results of recovery test（n=9）

2.10样品含量测定

取5批样品粉末各3份，每份约0.5 g，精密称定，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算各成分含量，结果见表6。

表6　样品含量测定结果（n=3，mg/g）Tab 6　Results of contents determination of samples（n=3，mg/g）

3　讨论

3.1检测波长的选择

在考察检测波长时，利用DAD检测器全波长图谱功能分别调出穿心莲内酯、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、脱水穿心莲内酯、山柰酚-3-O-葡萄糖苷的紫外吸收图谱，发现穿心莲内酯的最大吸收在225 nm处，脱水穿心莲内酯的最大吸收为254 nm，槲皮素-3-O-葡萄糖苷和山柰酚-3-O-葡萄糖苷的最大吸收峰均为335 nm，4个活性成分最大吸收波长相差较大，因此本试验采用了变换波长进行测定。

3.2提取溶剂的选择

本试验中对比了甲醇、乙醇、50%甲醇、50%乙醇、70%甲醇、70%乙醇作为提取溶剂的提取效率，结果发现采用70%乙醇超声提取2次，每次30 min，能将待测成分提取完全。

3.3流动相的选择

笔者还分别考察了乙腈-水、甲醇-水、甲醇-磷酸、乙腈-磷酸等流动相系统，发现选用乙腈-磷酸作为流动相时，基线稳定，样品的峰形和分离度都较好。因此，最终选择了甲醇-0.1%磷酸作为本试验的流动相。

3.4样品测定结果分析

对5批样品进行分析，结果表明各批复方穿心莲片样品均可检测出穿心莲内酯、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、脱水穿心莲内酯、山柰酚-3-O-葡萄糖苷4种成分，但各批次样品中上述4种成分的含量存在一定差异，可能与穿心莲、路边青原料来源及药用部位、生产制备工艺等有关。因此，有必要对复方穿心莲片中的有效成分进行质量控制，以保证复方穿心莲片的疗效。

综上所述，本方法简单灵敏、准确可靠、重复性好，可用于同时测定复方穿心莲片中穿心莲内酯、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、脱水穿心莲内酯、山柰酚-3-O-葡萄糖苷的含量。

［1］国家药典委员会.中华人民共和国卫生部药品标准中药成方制剂：第十九册［S］.北京：人民卫生出版社，1996：115.

［2］国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部［S］.2015年版.北京：中国医药科技出版社，2015：268、350.

［3］朱艳玲.穿心莲化学成分和药理作用的研究进展［J］.中国现代药物应用，2013，7（14）：238.

［4］刘飞飞，范春林，黄晓群，等.穿心莲干浸膏HPLC特征指纹图谱研究［J］.中药材，2007，38（7）：1 505.

［5］李景华，许笑笑，赵炎葱，等.穿心莲二萜内酯有效部位化学成分的液质联用法鉴定及其初步药效学研究［J］.中国中药杂志，2014，39（23）：4 642.

［6］王莉宁，徐必学，林华容，等.蓝布正化学成分的研究［J］.时珍国医国药，2009，20（4）：798.

［7］杨威，郑明善，吕惠子.路边青化学成分的研究［J］.延边大学医学学报，2013，36（1）：32.

［8］欧阳玉祝，陈小东，唐红玉，等.路边青中总多酚的提取与分离研究［J］.食品科学，2009，30（16）：44.

［9］张飞.蓝布正的化学成分及质量控制研究［D］.上海：上海交通大学，2012.

［10］李龙，翁恭峰，白玉春，等.复方穿心莲片质量标准的研究［J］.广东药学院学报，2014，30（5）：595.

［11］张慧晔，潘雪峰，徐小飞，等.复方穿心莲片的薄层鉴别研究［J］.中成药，2015，37（2）：460.

［12］胡强，周勇.HPLC法测定复方穿心莲片中脱水穿心莲内酯的含量［J］.中国当代医药，2013，20（3）：62.

［13］刘蕾，张瑜，韩光，等.HPLC法测定大鼠血浆中穿心莲内酯类衍生物的含量及其药动学研究［J］.中国药房，2013，24（11）：967.

［14］黄秀展，潘民儒，朱正英，等.HPLC法测定复方穿心莲片中穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯的含量［J］.中国社区医师，2012，14（7）：28.

（编辑：刘柳）

Simultaneous Determination of Four Components in Compound Chuanxinlian Tablet by HPLC

ZHAN Shiyin（Dept.of Pharmacy，Hubei Provincial Hospital of Integrated Chinese&Western Medicine，Wuhan 430015，China）

OBJECTIVE：To establish a method for the simultaneous determination of andrographolide，quercetin-3-O-glucoside，dehydroandrographolide and kaempferol-3-O-glucoside in Compound chuanxinlian tablet.METHODS：HPLC was performed on the column of Phenomenex C18with mobile phase of acetonitrile-0.1%phosphoric acid aqueous（gradient elution）at a flow rate of 1.0 ml/min，the detection wavelength was 225 nm for andrographolide，335 nm for quercetin-3-O-glucoside and 254 nm for dehydroandrographolide and kaempferol-3-O-glucoside，column temperature was 25℃，and the volume injection was 10µl.RESULTS：The linear range was 0.111-2.770µg for andrographolide（r=0.999 9），0.064-1.605µg for quercetin-3-O-glucoside（r= 0.999 9），0.086-2.138µg for dehydroandrographolide（r=0.999 9）and 0.050-1.260µg for kaempferol-3-O-glucoside（r=0.999 9）；the limits of quantitation were 0.48 ng，0.88 ng，0.93 ng and 1.03 ng，the limits of detection were 0.79 ng，1.15 ng，0.96 ng and 1.07 ng，respectively；RSDs of precision，stability and reproducibility tests were lower than 2.0%；recoveries were 96.57%-100.30% （RSD=1.3%，n=9），95.04%-98.87%（RSD=1.3%，n=9），95.74%-102.92%（RSD=2.4%，n=9）and 96.73%-100.95% （RSD=1.6%，n=9），respectively.CONCLUSIONS：The method is sensitive，reliable and reproducible，and can be used for the simultaneous determination of andrographolide，quercetin-3-O-glucoside，dehydroandrographolide and kaempferol-3-O-glucoside in Compound chuanxinlian tablet.

HPLC；Compound chuanxinlian tablet；Andrographolide；Quercetin-3-O-glucoside；Dehydroandrographolide；Kaempferol-3-O-glucoside

R917文献标志码A

1001-0408（2016）24-3425-04

10.6039/j.issn.1001-0408.2016.24.35

＊主管药师。研究方向：药品质量。E-mail：Zsy1835@qq.com

2016-02-29

2016-05-13）