免疫球蛋白重链基因重排检测在原发性胃肠道B细胞非霍奇金淋巴瘤中的应用研究

姜黄　郑丽华　杨金花

[摘要]目的探讨多聚酶链反应（PCR）检测免疫球蛋白重链基因重排在原发性胃肠道淋巴组织增生性疾病中的良恶性鉴别中的应用价值。方法选取存档蜡块45例，采用HE常规染色及SP免疫组化方法进行组织学分类，运用PCR半巢式扩增免疫球蛋白重链基因重排，2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。结果IgH FR3A和IgH FR3A+FR2A在MALT淋巴瘤的阳性检测率分别为60.7%（17/28）和75.0%（21/28），在DLBCL中的阳性检测率分别为60.0%（9/15）和73.3%（11/15），在MCL中的阳性检测率分别为100.0%（1/1）和100.0%（1/1）。IgH FR3A在胃肠道淋巴瘤中的阳性检测率为60.0%。IgH FR3A联合IgH FR2Ad在胃肠道淋巴瘤中的阳性检出率为73.3%（33/45）。结论采用PCR方法检测免疫球蛋白重链基因重排能够作为淋巴瘤诊断的有效辅助手段，有助于对原发性胃肠道淋巴组织增生性疾病的良恶性做出正确的诊断。

[关键词]胃肠道淋巴瘤；非霍奇金淋巴瘤；基因重排；多聚酶链反应；免疫球蛋白重链基因

[中图分类号]R733

[文献标识码]A

[文章编号]2095-0616（2016）03-29-04

淋巴瘤是起源于淋巴组织及淋巴结的恶性肿瘤，原发性胃肠道淋巴瘤是结外淋巴瘤的最好发部分。原发性胃肠道淋巴瘤占结外淋巴瘤的30%～45%。原发性淋巴瘤由于其临床表现无特殊性，尤其在早期的恶性淋巴瘤由于其更缺乏特异性，因此临床较难做出正确诊断，易造成误诊。病理诊断淋巴瘤较为可靠，借助形态学和免疫组织化学能对大部分淋巴瘤做出明确的诊断，但对一些疑难病例仍然不能做出正确诊断，未能得到及时的正确诊断不利于临床医生做出最佳的治疗方案和进行必要的预后评估。近年来，针对淋巴瘤免疫球蛋白重链（immunoglobulin heavy chain，IgH）基因重排检测已经成为临床上诊断淋巴瘤的一项必要手段，成为鉴别诊断淋巴瘤的一种新的有力工具，

本研究对此进行初步研究。

1.资料与方法

1.1一般资料

收集2008年10月～2014年10月郑州人民医院收治胃肠道B细胞非霍奇金淋巴瘤（Bcell non-Hodgkin lymphoma，B-NHL）45例，来自内镜活检和手术标本均经病理证实。男27例，女18例，年龄21-77岁（中位年龄52岁）。阳性对照为Raii细胞株，阴性对照为1例淋巴组织反应性增生。

1.2临床表现

45例胃肠道B-NHL患者中出现腹痛37例（82.2%），腹胀10例（22.2），血便10例（22.2%），发热8例（17.8%），腹部包块7例（15.6%），黑便6例（13.3%），消瘦5例（11.1%），黏液便5例（11.1%），腹泻2例（4.4%）。45例病变累及胃21例（46.7%），小肠2例（4.4%），回盲部3例（6.7%），结肠10例（22.2%），直肠3例（6.37%），小肠合并结肠1例（2.7%）。其中表现为淋巴结转移26例（57.8%），未查见淋巴结转移19例（42.3%）。

1.3方法

1.3.1免疫组化所有标本经中性福尔马林固定、常规石蜡包埋、4-5um连续组织切片，除进行常规HE染色以外，采用免疫组化S-P法进行免疫表型标记：LCA（2B11，DAKO）、CD3（F7.2.38，DAKO），CD45RO（OPD4，DAKO）、CD20（L26，DAKO）、CDIO（MX002，DAKO）、CDl5（Carb-3，DAKO）、CD30（Ber-2、DAKO）、Bcl-2（SP66，DAKO）、Bcl-6（LN22，DAKO）、CyclinD-1（DCS-6，DAKO）、PAX-5（SP34，DAKO）、kappalight chain（L1C1，DAKO）

和lambda light chain（LAM03+HP6054，DAKO）标记轻链。依据不同免疫表型表达情况并根据2008年WHO淋巴及造血系统肿瘤分类标准对所有病例进行分类。

1.3.2组织分型常规HE制片，结合免疫组化结果，所有病例经由2位以上病理学专家共同阅片确诊为非霍奇金B细胞淋巴瘤，其中胃肠道黏膜相关淋巴瘤（mucosa associated lymphoid tissuelymphoma，MALT）28例，弥漫大B细胞淋巴瘤（diffuse large B cell lymphoma，DLBCL）15例，滤泡性淋巴瘤（follicular lymphoma，FL）1例，套细胞淋巴瘤（mantle cell lymphoma，MCL）1例。

1.3.3DNA提取及半巢式PCR反应石蜡组织10um连续切片5张，常规酚一氯仿法抽提DNA。采用半巢式PCR。一致性v区引物（FR2A）：5TGGA/GTC CGC/A CAG G/CCT/C T/CCN GG 3一致性V区引物（FR3A）：5ACA CGG C（C/T）（G/C）TGT ATT ACT GT 3，（J区引物）LJH：5TGAGGA GAC GGT GAC C 3，（J区引物）VLJH：5GTG ACC AGG GT（A/G/C/T）CCT TGG CCCCAG 3。进行半巢式反应，第一轮PCR用引物FR3A（FR2A）+LJH，其产物稀释100倍作为模板，FR3A（FR2A）+VLJH进行第二轮PCR反应。总体积25uL：10×buffer 2.5uL，MgCl，1.8uL（终浓度1.8mM），dNTP 1.5uL（终浓度10uM），引物各0.2uL终浓度200nM），TaqPlus酶0.2uL（1u），模板DNA 1UL，体积不足部分双蒸水补足。所有PCR反应均在94℃预变性6min，94℃变性lmin，55℃退火lmin，72℃延伸lmin，40个循环，反应结束后在72℃延伸10min，然后4～C放置。产物长度70-130bp。已知阳性病例做阳性对照，反应性淋巴组织增生做阴性对照，缓冲液做空白对照。扩增产物行2%琼脂糖凝胶电泳。所需引物和试剂均购自上海生工公司。