光动力联合二氧化碳激光对复发性尖锐湿疣患者外周血CD4+、CD8+T细胞和调节性T细胞表达的影响

李志锋　李小静　李立红　刘保国.河北工程大学附属医院皮肤科，河北邯郸　056003；.河北省邯郸市中心医院皮肤科，河北邯郸　05600

光动力联合二氧化碳激光对复发性尖锐湿疣患者外周血CD4+、CD8+T细胞和调节性T细胞表达的影响

李志锋1李小静1李立红2刘保国1
1.河北工程大学附属医院皮肤科，河北邯郸056003；2.河北省邯郸市中心医院皮肤科，河北邯郸056001

目的 探讨光动力联合二氧化碳激光对复发性尖锐湿疣患者外周血CD4+、CD8+T细胞和调节性T细胞表达的影响。方法 选取2013年4月～2015年4月在河北工程大学附属医院（以下简称“我院”）皮肤科门诊就诊的复发性尖锐湿疣患者30例作为研究组，同时选取我院同期健康体检者20名作为健康对照组。研究组给予光动力联合激光治疗。应用流式细胞仪检测研究组治疗前后及健康对照组外周血中T细胞亚群以及CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞的百分比。结果 研究组治疗前CD4+/CD8+比值 （1.19±0.98）明显低于健康对照组 （1.98± 0.30），差异有统计学意义（P＜0.05），治疗后CD4+/CD8+比值（1.75±0.78）与健康对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。研究组治疗前和治疗后外周血中CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞百分比分别为 （13.92±12.65）%和（8.38±2.79）%，均明显高于健康对照组［（4.22±4.26）%］，差异有统计学意义（P＜0.05）；与治疗前比较，治疗后CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞百分比明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。结论 复发性尖锐湿疣患者存在免疫功能异常，处于免疫失衡状态。光动力可以调节复发性尖锐湿疣患者失衡的免疫状态，以利于皮损消退。

光动力疗法；二氧化碳激光治疗；复发性尖锐湿疣；免疫功能

［Abstract］Objective To explore the effect of photodynamic therapy combined with carbon dioxide laser therapy for the expression of CD4+，CD8+T cells and regulatory T cells of peripheral blood in patients with recurrent condyloma acuminatum.Methods Thirty cases of patients with recurrent condyloma acuminatum treated in Outpatient Department of Dermatology，Affiliated Hospital of Hebei Engineering University（“our hospital”for short）from April 2013 to April 2015 were selected as study group，20 healthy controls examined in our hospital at the same time were selected as healthy control group.The study group was given photodynamic therapy combined with carbon dioxide laser therapy. Flow cytometry was used to detect the percentages of T lymphocyte subsets and CD4+CD25+Foxp3+T regulatory cells of peripheral blood in study group before and after treatment and healthy control group.Results The ratio of CD4+/CD8+in study group before treatment（1.19±0.98）was lower than that of healthy control group（1.98±0.30），the difference was statistically significant（P＜0.05），after treatment，the ratio of CD4+/CD8+in study group（1.75±0.78）had no statistically significant difference with healthy control group（P＞0.05）.The percentage of CD4+CD25+Foxp3+T regulatory cells of peripheral blood in study group before and after treatment was（13.92±12.65）%and（8.38±2.79）%respectively，which were all higher than that of healthy control group［（4.22±4.26）%］，the differences were statistically significant（P＜0.05）；compared with before treatment，the percentage of CD4+CD25+Foxp3+T regulatory cells after treatment was decreased，the difference was statistically significant（P＜0.05）.Conclusion The immune function of patients with recurrent condyloma acuminatum is abnormal，which is in a state of imbalance.Photodynamic can adjust the immune unbalance of patients with recurrent condyloma acuminatum，which is helpful for the extinction of skin lesions.

［Key words］Photodynamic therapy；Carbon dioxide laser therapy；Recurrent condyloma acuminatum；Immune function

尖锐湿疣是由人类乳头状瘤病毒（HPV）感染所致，该病容易复发，传染性强。研究显示患者的细胞免疫功能可能与尖锐湿疣的复发有密切的关系［1］。光动力和二氧化碳激光是目前尖锐湿疣的主要治疗手段。许多研究表明光动力治疗明显降低了尖锐湿疣的复发率［2-4］，可能与光动力能杀灭湿疣周边潜伏病毒有关。但光动力对机体细胞免疫功能的影响的研究很少，本研究应用流式细胞仪检测复发性尖锐湿疣患者光动力联合二氧化碳激光治疗前后外周血CD4+、CD8+、CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞百分比，探讨复发性尖锐湿疣患者的免疫功能状况以及光动力联合激光治疗后对复发性尖锐湿疣患者免疫系统的影响。

1　资料与方法

1.1一般资料

入选的30例男性患者均来自河北工程大学附属医院（以下简称“我院”）2013年4月～2015年4月皮肤性病门诊，根据赵辨主编的《中国临床皮肤病学》［5］中尖锐湿疣的诊断标准确诊。入选标准：①有非婚性接触史或配偶感染史；②疣体醋酸白实验阳性；③病理可见明显的凹空细胞；④近3个月内至少复发1次的男性患者。排除标准：①有皮肤光过敏症、卟啉病或对卟啉类过敏者；②梅毒、淋病、支原体及衣原体感染、HIV感染及糖尿病；③近1个月曾使用过免疫调节药物或其他细胞毒性药物者。对照组为我院同期健康体检的20名男性志愿者。

1.2方法

材料ALA（5-氨基酮戊酸，商品名艾拉），为上海复旦张江生物医药股份有限公司产品，规格为118 mg/瓶。试验光源：光源为波长635 nm半导体激光器，上海复旦张江生物医药股份有限公司技术开发监制。二氧化碳激光：输出功率为4～50 J/cm2，激光型号 （科英JC100D型），临床治疗时根据皮损大小选择适当的输出功率。二氧化碳激光联合光动力治疗：常规消毒治疗区域及周围正常皮肤，2%的利多卡因局部浸润麻醉，根据皮损部位、大小及深度调节激光输出功率，治疗范围超过疣体基底的1～2 mm。治疗后的创面局部外用莫匹罗星乳膏预防感染。经二氧化碳激光治疗后7～10 d进行光动力治疗，每周1次，连续治疗3次。治疗前用生理盐水将ALA粉稀释成20%的溶液，然后用灭菌生理盐水清洗患者外阴，将新鲜配制的20% ALA溶液均匀涂于原皮损处及周围2 cm范围，塑料薄膜封包，3 h后波长635 nm的光动力治疗仪照射，能量密度为100 J/cm2。

1.3外周血T细胞亚群和调节性T细胞测定

应用流式细胞仪检测复发性尖锐湿疣患者光动力联合二氧化碳激光治疗前及3次治疗后外周血中CD4+、CD8+细胞的百分比、CD4+/CD8+比值及CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞百分比，并与健康对照组比较。抽取30例研究组患者激光治疗前、光动力3次治疗后及健康对照组静脉血4 mL，注入真空采血管中，采用乙二胺四乙酸抗凝，于采集后4 h内进行实验。实验方法：流式细胞仪检测：抽取两组受试者肝素抗凝血100 μL，加入淋巴细胞检测试剂25 μL，混匀，室温避光染色20 min；加入2 mL红细胞裂解液，室温避光放置10 min；1500 r/min离心5 min弃上清液，加磷酸盐缓冲液2 mL，混匀，1500 r/min离心5 min弃上清液，加入2%多聚甲醛PBS 500 mL固定，放置4～8℃冰箱待检测。每管加细胞液100 μL，加入10 μL抗CD4-mAb-PerCP、抗CD8-mAb-PerCP、抗CD4+CD25+Foxp3+mAb-PerCP，室温避光放置15 min；红细胞溶解液0.5 μL溶解红细胞15 min；破膜剂Ⅰ、Ⅱ固定和破膜；PBS 3 mL，1200 r/min离心5 min，弃上清；加细胞因子抗体，每份标本分别加同型对照IgG-FITC；温室避光放置15 min；加PBS 4 mL，1200 r/min，离心10 min，弃上清；适量PBS重悬细胞上流式细胞仪检测；每份标本检测1万个细胞，在CD4+T淋巴细胞中，根据阴性对照实验结果，以CD25、Foxp3设门，分析CD4+CD25+Foxp3+细胞占CD4+T淋巴细胞的比例。结果以阳性细胞百分率（%）表示，并经Cell Quest功能软件进行参数获取和数据分析。

1.4统计学方法

所有数据采用SPSS 20.0软件处理，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1研究组治疗前后和健康对照组外周血T淋巴细胞亚群检测结果比较

研究组治疗前CD4+T细胞百分比明显低于健康对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。研究组治疗后CD4+T细胞百分比较治疗前明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。研究组治疗后CD4+T细胞百分比与健康对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。研究组治疗前CD8+T细胞百分比高于健康对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。研究组治疗后CD8+T细胞百分比较治疗前下降，差异有统计学意义（P＜0.05）。研究组治疗后CD8+T细胞百分比与健康对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。研究组治疗前CD4+/CD8+比值明显低于健康对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。研究组治疗后CD4+/CD8+比值较治疗前明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。研究组治疗后CD4+/ CD8+比值虽然仍低于健康对照组，但两组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1　研究组治疗前后和健康对照组外周血T淋巴细胞亚群检测结果比较（%，x±s）

2.2研究组光动力治疗前后CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞占CD4+T细胞的百分比结果

研究组治疗前和治疗后外周血中CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞占CD4+T细胞的百分比分别为（13.92±12.65）%和（8.38±2.79）%，均明显高于健康对照组［（4.22±4.26）%］，差异有统计学意义（P＜0.05）。与治疗前相比，研究组治疗后CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞占CD4+T细胞的百分比降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。

3　讨论

尖锐湿疣的迁延不愈和顽固难治与机体的细胞免疫和体液免疫功能有关。细胞免疫在控制HPV的激活、复制以及对治疗的反应起着主要的调节作用。其中T淋巴细胞亚群在人体抗病毒细胞免疫中起主导作用，而CD4+/CD8+T淋巴细胞比值是用于衡量细胞免疫功能的主要指标［6-8］。正常机体内各淋巴细胞亚群和细胞因子相互作用并保持一定的平衡。本研究通过检测光动力联合激光治疗复发性尖锐湿疣患者治疗前后T细胞亚群及调节性T细胞比例，并与健康志愿者对比，研究复发性尖锐湿疣患者细胞免疫功能状态及光动力联合激光对复发性尖锐湿疣患者细胞免疫功能的影响。

本研究显示，研究组治疗前外周血CD4+T细胞百分比和CD4+/CD8+比值与健康对照组比较均明显下降，CD8+T细胞百分比明显高于健康对照组。李嘉彦等［9］研究结果显示，尖锐湿疣患者外周血中CD4+T细胞百分比、CD4+/CD8+比值下降，显著低于健康成人，而CD8+T细胞百分比明显高于健康成人。与本研究结果一致。CD4+T细胞亚群根据细胞因子分泌模式的不同分为两个亚群，即Th1和Th2细胞。Th1型细胞因子IFN在清除病毒中起着重要的作用。HPV感染机体时出现了Th1优势应答向Th2优势应答转化，IFN因子分泌减少。CD8+T细胞发挥细胞毒作用，需要Th1细胞因子的协同，当CD4+/CD8+比值异常时，其辅助作用降低，Tc对病毒感染细胞的细胞毒性活性下降，即出现免疫效应的低下，导致对HPV清除能力下降。目前未见到CD8+T细胞反馈抑制CD4+T细胞的证据，尖锐湿疣外周血CD4+T细胞较健康人明显降低的原因不清楚，推测HPV病毒可能通过某种机制抑制Th活化或增殖［10］。CD8+T细胞明显升高可能与病毒弱抗原的不断刺激和不断活化有关。在乙肝病毒感染时，患者外周血CD4+、CD8+T细胞计数都是降低的，且病毒越活跃，CD8+T越低。而在尖锐湿疣患者中出现CD4+T降低、CD8+T升高分离的状态，其原因有待进一步研究［11］。本研究结果显示CD4+T细胞百分比和CD4+/CD8+比值的下降提示尖锐湿疣患者机体存在免疫功能异常。

近年来认为，CD4+CD25+Foxp3+调节性 T细胞（Treg细胞）是一类具有免疫负调节作用的T细胞亚群［12］，在疾病的免疫调节网络中发挥重要的作用，其主要通过细胞间直接接触和分泌抑制性因子，如转化生长因子-β（TGF-β）、白细胞介素10（IL-10）等发挥免疫抑制作用。CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞对维持机体免疫耐受和免疫应答稳态具有非常重要的作用，可以使机体在自身损伤最小的情况下有效地清除抗体或病原体。本研究显示尖锐湿疣患者治疗前Treg细胞百分比明显高于健康对照组，提示机体受到HPV病毒感染时，体内T细胞向Treg分化明显增强，抑制细胞免疫，使病毒能够逃避免疫细胞清除。林建华等［13］研究发现尖锐湿疣患者的外周血中Treg细胞较正常健康对照组显著增加，而且复发性尖锐湿疣比初诊患者其水平更高。与本研究结果一致，表明尖锐湿疣患者存在免疫抑制。Zhao等［14］报道清除Treg有利于尖锐湿疣治疗，证明Treg参与T细胞对HPV的免疫效应。但目前尚不清楚Treg的增多导致了持续的病毒感染，亦或是病毒持续感染诱导的Treg的数量增多。

光动力作为复发性尖锐湿疣的一种新型的治疗方法，其有效性已被证实［15-17］。本研究发现复发性尖锐湿疣患者治疗前CD4+T细胞百分比明显低于健康对照组，而经过光动力3次治疗后CD4+T细胞水平有了提高，与健康对照组比较差异无统计学意义。CD4+/CD8+比值可以作为反映机体抗病毒免疫状态的重要指标。本研究治疗前CD4+/CD8+比值明显低于健康对照组，经光动力治疗后CD4+/CD8+比值增高，与治疗前比较差异有统计学意义（P＜0.05）。治疗后CD4+/CD8+比值虽然仍低于健康对照组，但与后者比较差异无统计学意义（P＞0.05）。CD4+T细胞百分比和CD4+/CD8+比值增高提示二氧化碳激光联合光动力治疗后复发性尖锐湿疣患者机体的免疫失衡状态有了改善，增强了对HPV感染的清除能力。此外，本研究发现研究组光动力治疗前外周血中CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞占CD4+T细胞的百分比明显高于健康对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），说明CA患者体内T细胞向Treg分化明显增强，细胞免疫受到抑制。二氧化碳激光联合光动力治疗后与治疗前相比，CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞的百分比明显降低，两者之间差异有统计学意义，表明二氧化碳激光联合光动力治疗可有效降低CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞的百分比，纠正免疫失衡状态。治疗后CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞的百分比仍高于健康对照组，与后者比较有统计学差异，表明二氧化碳激光联合3次光动力治疗后尖锐湿疣患者仍存在免疫抑制，为预防复发可能需要密切随访观察或增加光动力治疗次数。研究表明光动力联合二氧化碳激光能有效调节细胞免疫功能［18］，与本研究结果一致。

综上所述，本研究结果显示，复发性尖锐湿疣患者存在明显的免疫失衡状态，而光动力联合二氧化碳激光治疗可以调节复发性尖锐湿疣患者T细胞亚群的失衡，降低Treg细胞百分比，提高患者的全身免疫功能，值得临床推广应用。

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Effect of photodynamic therapy combined with carbon dioxide laser therapy for the expression of CD4+，CD8+T cells and regulatory T cells of peripheral blood in patients with recurrent condyloma acuminatum

LI Zhifeng1LI Xiaojing1LI Lihong2LIU Baoguo1
1.Department of Dermatology，Affiliated Hospital of Hebei Engineering University，Hebei Province，Handan056003，China；2.Department of Dermatology，Handan Central Hospital，Hebei Province，Handan056001，China

R752.5

A

1673-7210（2016）08（b）-0138-04

2016-05-10本文编辑：张瑜杰）

河北省邯郸市科学技术研究与发展计划项目（1223108086）。

李志锋（1978-），男，硕士；研究方向：皮肤病性病及皮肤美容。