麦角甾醇含量检测分析柑橘真菌污染程度的方法研究

唐艳斌，段晓艳，王丽娟，陈頔，杨蕾

（1.中国疾病预防控制中心营养与健康所，国家卫生计生委微量元素重点实验室，北京100050；2.云南同创检测技术股份有限公司检测事业部，云南昆明650106；3.云南师范大学生命科学学院，云南昆明650031）

麦角甾醇含量检测分析柑橘真菌污染程度的方法研究

唐艳斌1，段晓艳3，王丽娟1，陈頔1，杨蕾2*

（1.中国疾病预防控制中心营养与健康所，国家卫生计生委微量元素重点实验室，北京100050；2.云南同创检测技术股份有限公司检测事业部，云南昆明650106；3.云南师范大学生命科学学院，云南昆明650031）

建立了以7-去氢胆固醇为内标，气质联用（GC-MS）法同步选择离子检测/全扫描的定量检测方法，并采用该方法检测了不同程度霉变的柑橘中的麦角甾醇含量，确定柑橘的真菌污染程度。结果表明，麦角甾醇在5～200 μg/mL质量浓度范围内具有良好的线性关系（R2=0.999 9）；检出限和定量限分别为3.12 mg/kg、10.39 mg/kg，加标回收率范围在91.33%～100.14%，日内相对标准偏差为0.04～0.49%、日间相对标准偏差为0.22%。该方法简便、灵敏、准确，麦角甾醇含量可作为柑橘早期受真菌侵染的重要指标。

麦角甾醇；柑橘；真菌侵染；气相色谱-质谱联用

柑橘是世界上产量最大的水果，具有较高营养价值、药用价值和保健作用［1］。我国柑橘的产销量为世界第一，以鲜果销售为主，而柑橘的生产地较为分散，且离城市较远，成熟期相对集中。因此，柑橘采收后需要经过一定的储藏和运输周期，在这一段时期，柑橘鲜果的品质受到诸多因素的影响而恶化，如柑橘果肉组织的生理变化失调或衰老、采收、包装或运输过程中的机械损伤以及病原微生物的侵染等。水果的采后病害导致巨大损失是一个全球性的问题，其中微生物的侵染是其中最主要的原因［2］。柑橘贮藏病害主要由真菌引起，由意大利青霉（Penicillium italicum）引起的青霉病和指状青霉（Penicillium digitatum）引起的绿霉病的腐烂最为严重［3-4］。每年因病害造成柑橘腐烂损失率高达10%～30%，严重的竟达到60%以上［2］。因此，对柑橘受真菌侵染情况进行测定，采取有效措施进行病害的防治是非常有必要的。

当前，对柑橘是否受真菌侵染的检测一般采用肉眼观察是否长出真菌菌丝体、鼻闻是否出现霉味等感官手段［5-9］，或者通过对真菌进行分离、培养后，在培养基上计算菌落数量来表征［10-11］。人工方法较大的依赖于人的感官判断，而真菌菌落计数需要培养5 d以上，耗时较长。同时，这些方法都无法对柑橘鲜果早期受真菌侵染进行判定。

麦角甾醇，别名24β-甲基胆固醇-5，7烯-3β-烃基，是存在于真菌细胞膜中的一种固醇类化合物，大多以自由态存在于真菌细胞膜的磷脂双分子层中，少量酯化于脂肪酸中。在高等植物中不存在麦角甾醇，其良好的特异性和稳定性可以有效地表征高等植物中真菌的生物量，反映植物受真菌侵染的程度［12］。目前，麦角甾醇检测方法有高效液相色谱法［13-17］、紫外可见分光光度法［17］以及质谱法［18］等。

本研究通过溶剂加热超声波萃取，将柑橘中的麦角甾醇提取、纯化、浓缩富集后进行衍生化处理，应用气相色谱-质谱（gaschromatography-massspectrometry，GC-MS）联用仪，在选择离子模式下对衍生化后的麦角甾醇进行定量测定，并对所建立的检测方法进行评价。通过麦角甾醇含量的变化反映柑橘受真菌侵染情况，以达到有效监控柑橘早期霉变的目的，从而保证柑橘质量及安全。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

柑橘：市售；麦角甾醇标准品（纯度≥99.0%）：德国Dr.Ehrenstorfer公司；7-去氢胆固醇（内标）：上海安谱科学仪器有限公司；双三甲基硅烷基三氟乙酰胺（bis（trimethylsilyl）trifluoroacetamide，BSTFA）（纯度≥99.0%）：东京化成工业株式会社；甲醇（色谱纯）：迪马科技有限公司；二氯甲烷（色谱纯）：西陇化工股份有限公司分析纯重蒸；正己烷（色谱纯）：美国默克公司。

1.2仪器与设备

AE200型电子分析天平：瑞士Mettler Toledo公司；6890N气相色谱-5975C质谱联用仪：美国Agilent公司；S900H超声波清洗机：德国Elma公司。

1.3方法

1.3.1标准溶液的配制

准确称取麦角甾醇标准品100.0 mg，用二氯甲烷溶解并定容至100 mL容量瓶中，配制成质量浓度为1 mg/mL的标准储备液。依次用二氯甲烷稀释麦角甾醇储备液，配制质量浓度分别为5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL的麦角甾醇标准曲线溶液。

准确称取7-去氢胆固醇标准品100.0 mg，用二氯甲烷溶解并定容至100 mL［21］，配制成质量浓度为1 mg/mL的内标溶液。

1.3.2样品前处理

将柑橘样品于105℃烘箱中烘干，经旋风磨粉碎过60目筛后备用。准确称取2.00g柑橘样品，置于50mL具盖玻璃瓶中，加入20 mL重蒸后的二氯甲烷，旋紧瓶盖，于35℃条件下超声（超声功率100 W、频率50～60 Hz）萃取1 h后静置30 min，取上层清液，用有机滤头过滤后取1.0 mL置于2 mL色谱瓶中，加入100 μL质量浓度为1 mg/mL 7-去氢胆固醇内标溶液后，在40℃水浴中挥干溶剂，加入300 μL BSTFA衍生化试剂，并于80℃条件下衍生化45 min，进行GC-MS分析。

1.3.3气相色谱-质谱联用仪条件

气相色谱条件：HP-5MS色谱柱（30m×0.25mm×0.25μm）；程序升温方式：初始温度100℃，保持1 min，以30℃/min的升温速率升至280℃，保持24 min，总运行时间31 min。载气：氦气（He）；流速1.0 mL/min，进样口温度260℃，进样量2 μL，分流比10：1。

质谱条件：电离方式为电子电离（electronionization，EI）源，电子能量70 eV，离子源温度230℃，四级杆温度150℃，传输线温度280℃，质谱扫描方式：选择离子监测（selectedion monitoring，SIM），扫描范围50～550 m/z，溶剂延迟10 min。

1.3.4定性定量的方法

定性方法：通过质谱在50～550 m/z范围内全扫描麦角甾醇特征离子和麦角甾醇标准品，以保留时间定性。

定量方法：以麦角甾醇标准品外标法定量。

1.3.5萃取条件参数的选择和优化

选取对超声萃取影响较大的萃取溶剂、萃取温度和萃取时间3个参数，分别选择用甲醇、二氯甲烷、正己烷作为萃取溶剂；选择30℃、35℃、40℃、45℃作为萃取温度水平；选择30 min、45 min、60 min、120 min作为萃取时间水平，分别进行单因素试验，获取最佳萃取条件。

1.3.6麦角甾醇标准曲线的制作

分别取质量浓度为5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL的1.0mL麦角甾醇标准曲线溶液与100 μL质量浓度为1 mg/mL内标储备液于2.0 mL色谱瓶中。在40℃水浴中挥干溶剂后加入300 μL BSTFA衍生试剂，80℃条件下衍生45 min，备用。

采用气相色谱-质谱联用仪测定麦角甾醇的标准系列溶液和GC-MS分析，用峰面积对其相应质量浓度进行回归分析，得到麦角甾醇和内标的积分峰面积，用麦角甾醇的积分峰面积与内标峰面积的比值（Y）作为纵坐标，麦角甾醇质量浓度与内标质量浓度比值（X）作为横坐标，建立麦角甾醇的标准曲线。

1.3.7方法学评价

应用方法线性范围、检出限（limit of detection，LOD）和定量限（limit of quantitation，LOQ）、加标回收率、重现性和再现性对建立的柑橘中麦角甾醇含量测定方法进行方法学评价。

1.3.8霉变柑橘中麦角甾醇的测定方法

（1）不同贮存条件柑橘样品中麦角甾醇含量测定

选取20个柑橘鲜果，随机选取其中10个放置于相对湿度（relative humidity，RH）为80%、温度28℃环境条件下，以加速真菌的生长增殖；剩余的10个放置于相对湿度20%、温度28℃环境条件下避光保存，15 d后分别对不同贮存条件下的柑橘样品进行麦角甾醇含量的测定。

（2）真菌侵染不同程度柑橘样品中麦角甾醇含量测定

选取10个柑橘鲜果，放置于RH为80%、温度28℃环境条件下，连续培养18 d。每3 d取样一次，对不同霉变程度的柑橘样品进行麦角甾醇含量的测定。

2　结果与分析

2.1萃取条件参数的选择和优化

通过选取对超声萃取影响较大的萃取溶剂、萃取温度和萃取时间3个参数，分别进行单因素试验，以麦角甾醇在GC-MS分析的响应强度（峰面积）为评价指标，进行萃取条件参数和水平的优化。萃取溶剂、萃取温度和萃取时间对麦角甾醇萃取效果的影响，结果见表1、表2及图1。

表1　不同萃取溶剂对麦角甾醇萃取效果的影响Table1 Effect of different extraction solvent on ergosterol extraction

表2　不同萃取温度对麦角甾醇萃取效果的影响Table 2 Effect of different extraction temperature on ergosterol extraction

图1　不同萃取时间对麦角甾醇萃取效果的影响Fig.1 Effect of different extraction time on ergosterol extraction

由表1可知，以二氯甲烷为萃取溶剂，35℃萃取温度下萃取30 min时，麦角甾醇峰面积最大，为48 125，获得较好的萃取效果；由表2可知，以二氯甲烷为萃取溶剂，在不同萃取温度下萃取30 min时，35℃萃取温度下，麦角甾醇峰面积最大，为47 908，获得较好的萃取效果；由图1可知，以二氯甲烷为萃取溶剂，35℃萃取温度下萃取时，60 min后可以达到萃取平衡。因此，最佳萃取条件为：二氯甲烷为萃取溶剂，在35℃萃取温度条件下萃取60 min。

2.2方法评价

2.2.1线性回归方程、检出限和定量限

按照1.3.1配制麦角甾醇标准溶液，加入100 μL质量浓度为1 mg/mL7-去氢胆固醇内标溶液后，在40℃水浴中挥干溶剂，加入300 μL BSTFA衍生化试剂，并于80℃条件下衍生化45min，进行GC-MS分析。以麦角甾醇峰面积与7-去氢胆固醇内标峰面积的比值（Y）为纵坐标，其相应质量浓度比值（X）为纵坐标，绘制麦角甾醇标准曲线见图2。

图2　麦角甾醇标准曲线Fig.2 Standard curve of ergosterol

由图2可知，标准曲线线性回归方程为Y=165.3X，相关系数R2=0.9999，结果表明，在5～200μg/mL质量浓度范围，二者线性关系良好。方法的LOD和LOQ以最低浓度点加入柑橘样品，重复进样10次，由测得的质量浓度值统计出标准偏差，LOD以3倍标准偏差、LOQ以10倍标准偏差求得，分别为3.12 mg/kg和10.39 mg/kg。

2.2.2加标回收率

方法的回收率实验采用基质加标法，在样品中加入麦角甾醇标准品，按照上述分析步骤操作，测得本底、低、中、高加标4个水平下的各麦角甾醇的含量，每个水平平行测定3次，计算方法回收率［（加标测定值-本底值/加标量）］及相对标准偏差（relative standard deviation，RSD），结果见表3。

表3　加标回收率试验结果Table 3 Results of standard recovery rate tests

由表3可知，麦角甾醇的平均回收率在91.33%～100.14%，相对标准偏差（RSD）在0.09%～1.31%。说明该方法准确度较好，能够满足定量分析要求。

2.2.3方法的重复性和再现性

采用1个霉变柑橘样品，每天平行测定6次麦角甾醇含量，连续测定3 d，分别计算日内相对标准偏差（RSD，n=6）及日间相对标准偏差（RSD，n=3），结果见表4。由表4可知，日内相对标准偏差为0.04%～0.49%，日间标准偏差为0.22%，均在1%以内，满足检测需求。

表4　重复性和再现性试验结果Table 4 Results of repeatability and reproducibility tests

2.3麦角甾醇含量检测方法在柑橘中的应用实验

2.3.1不同贮存条件下柑橘样品中麦角甾醇含量的测定

按照1.3.8中两种不同贮存条件处理柑橘样品，15 d后，测定其柑橘样品中麦角甾醇含量结果见表5。

表5　不同条件下贮存柑橘样品中麦角甾醇含量测定结果Table 5 Determination results of ergosterol content in fungal-contaminated citrus samples under different storage conditions

由表5可知，在相对湿度为80%环境条件下贮存的柑橘样品中测定出麦角甾醇的含量为13.79～68.42 mg/kg，而正常柑橘样品中麦角甾醇的含量为1.342～2.80 mg/kg，受到真菌侵染的柑橘样品中麦角甾醇含量比正常样品中高出10倍以上。通过肉眼观察，存放在RH80%环境条件下的10个柑橘表现出不同程度的霉变；而存放在RH 20%、避光环境条件下的10个柑橘外观正常。结果表明，当保藏条件不利于真菌生长的时候，菌丝体或孢子处于潜伏状态，停止活动，麦角甾醇的含量处于稳定的水平，但是当保藏条件处于高温湿润状态，则有利于真菌生长，孢子萌发，菌丝体生长，麦角甾醇的含量远高于干燥保藏条件下［19］。因此，可以通过应用麦角甾醇含量反映柑橘鲜果是否受到霉菌侵染，快速有效的发现鲜果真菌危害，及时采取防治措施。

2.3.2真菌侵染程度不同的柑橘样品测定

对10个不同真菌侵染程度柑橘样品进行麦角甾醇含量的测定，结果见图3。

图3　不同真菌侵染程度的柑橘样品中麦角甾醇含量变化趋势Fig.3 Variation trend of ergosterol contents in fungal-contaminated citrus samples with different levels

由图3可知，随着受到真菌侵染时间的增长，麦角甾醇的含量逐渐增加，在第18天时达到最大值。同时，也发现在第12天时出现一个拐点，增加的速度加快；15d后急剧增加，在3 d内迅速增加到其实浓度的30倍以上。因此，通过麦角甾醇含量的变化可以判断柑橘受真菌侵染的时间。

3　结论

本实验建立了采用溶剂加热超声波萃取-衍生化-气相色谱-质谱联用测定柑橘中麦角甾醇含量的方法，并以麦角甾醇含量的变化来判断柑橘受真菌侵染情况。得出如下主要结论：

（1）对萃取影响较大的萃取溶剂、萃取温度和萃取时间3个参数进行优化。结果表明，以二氯甲烷为萃取溶剂，35℃萃取温度条件下萃取60 min能达到较好的萃取效果。

（2）麦角甾醇在5～200 μg/mL质量浓度范围具有良好的线性关系（R2=0.9999）；检出限和定量限分别为3.12mg/kg、10.39 mg/kg，加标回收率范围在91.33%～100.14%，日内相对标准偏差为0.04%～0.49%、日间相对标准偏差为0.22%。该方法简便、灵敏、准确。

（3）对不同霉变程度的柑橘样品中麦角甾醇进行了测定，结果显示新鲜健康的柑橘中麦角甾醇含量极低，随着霉变程度的加深，麦角甾醇含量增加，麦角甾醇含量可作为反映柑橘早期受真菌侵染的重要指标。

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TANG Yanbin1，DUAN Xiaoyan3，WANG Lijuan1，CHEN Di1，YANG Lei2*
（1.National Institute for Nutrition and Health，Chinese Center for Disease Control and Prevention，Key Laboratory of Trace Element Nutrition，National Health and Family Planning Commission of the People's Republic of China，Beijing 100050，China；2.Testing Centre，Yunnan Comtestor Co.，Ltd.，Kunming 650106，China；3.School of Life Sciences，Yunnan Normal University，Kunming 650092，China）

A quantitative determination method by GC-MS with synchronize seletion ion monitoring/full scan mode was established by using 7-dehydrocholesterlo as internal standard.The contents of ergosterol in fungal-contaminated citrus with different levels were determined.The results showed that the calibration curve exhibited good linearity with a correlation coefficientR2of 0.999 9 in the range of 5-200 μg/ml.The limit of detection（LOD）and limit of quantitation（LOQ）were 3.12 mg/kg and 10.39 mg/kg，respectively.The adding standard recovery rate ranged from 91.33%to 100.14%with the intra-day relative standard deviation of 0.04～0.49%and inter-day relative standard deviation 0.22%.The method was simple，sensitive and accurate，and ergosterol contents could be as an important indicator in early fungal-contaminated citrus.

ergosterol；citrus；fungal contamination；GC-MS

O657.63

0254-5071（2016）06-0050-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.06.011

2016-04-29

国家高技术研究发展计划‘863计划’（2010AA023004）

唐艳斌（1983-），女，助理研究员，博士，主要从事食品生物术及营养与健康研究工作。

杨蕾（1983-），女，工程师，博士，主要从事食品分析检测研究工作。