糯米酒酿造酵母的优选

杨子琳，伍时华，赵东玲，黄翠姬，杨丽峰

（广西科技大学生物与化学工程学院，广西柳州545006）

糯米酒酿造酵母的优选

杨子琳，伍时华，赵东玲*，黄翠姬，杨丽峰

（广西科技大学生物与化学工程学院，广西柳州545006）

为了优选酵母菌种，改善液态发酵糯米酒的口感，采用酿酒酵母SJ4、扣囊复膜酵母3-1Y、粟酒裂殖酵母SP单菌种发酵及酿酒酵母/扣囊复膜酵母（1∶1）、酿酒酵母/粟酒裂殖酵母（1∶1）、酿酒酵母/扣囊复膜酵母/粟酒裂殖酵母（1∶1∶1）混合菌种发酵方式酿造糯米酒，通过曲线下面积（AUC）、主成分分析（PCA）对糯米酒风味物质及理化指标进行分析。结果表明，扣囊复膜酵母3-1Y与酿酒酵母SJ4（1∶1）混合发酵时AUC值最小，为9 371，相对贡献值最大，为3.448 7；糯米酒中总酸和氨基酸态氮含量有所提高，产品共检测了12种风味物质，总酯含量有增加，甲醇及高级醇有所降低，感官评分为7分，最适用于糯米酒的发酵。

糯米酒；酵母菌；优选；主成分分析；风味物质

糯米酒富含氨基酸、多糖、维生素等营养成分［1］，因液态酿造糯米酒能有效缩短发酵周期［2］，解决了传统发酵劳动强度大、生产周期长的问题，成为工艺研究的重点。酵母是酒曲中主要的发酵菌，酵母菌种的优劣直接影响糯米酒的品质［3］，以往研究的侧重点多是从糯米酒或是酒曲中筛选酵母菌［4］，或是为了保证糯米酒中适当的酒精度，片面筛选发酵能力较强的酿酒酵母，所得糯米酒口味淡薄，风味欠佳［5-6］。近年来有关产香能力较强的非酿酒酵母的研究逐年增多，酿酒酵母与非酿酒酵母混合发酵中酵母之间的相互作用和风味物质的差异分析也成为研究的热点［7］。

为了得到适合于糯米酒液态发酵的酵母菌，改善糯米酒的口感，本试验选取米根霉8-3M作为唯一的糖化霉菌，采用酿酒酵母SJ4、扣囊复膜酵母3-1Y、粟酒裂殖酵母SP单菌种发酵及酿酒酵母/扣囊复膜酵母（1∶1）、酿酒酵母/粟酒裂殖酵母（1∶1）、酿酒酵母/扣囊复膜酵母/粟酒裂殖酵母（1∶1∶1）混合菌种发酵方式酿造糯米酒，采用曲线下面积（area under curve，AUC）、主成分分析（principal component analysis，PCA）等分析手段比较各理化指标、风味物质的差异，优选出适用于糯米酒液态发酵的酵母菌株，为糯米酒工业化生产奠定基础。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

1.1.1原料与试剂

糯米：市售。甲醇（分析纯）：成都市科龙化工试剂厂；氢氧化钠（分析纯）：广东光华科技股份有限公司；高温α-淀粉酶（20 000 U/mL）：山东隆大生物工程有限公司；无水乙醇（色谱纯）：上海展云化工有限公司；白酒成分分析标准物质（色谱纯）：贵州省计量测试院。

1.1.2发酵菌株

米根霉（Rhizopus oryzae）8-3M、扣囊复膜酵母（Saccharomycopsis fibuligera）3-1Y、栗酒裂殖酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）SP、酿酒酵母（Saccharomy cescerevisiae）SJ4：本课题组实验室保藏。

1.1.3培养基

酵母菌种子培养基：酵母浸膏10 g/L，葡萄糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，pH自然，在115℃条件下高压蒸汽灭菌30 min。

霉菌种子培养基：200 g糯米加水浸泡4 h，将浸泡好的糯米沥干后置于水浴锅中，加水至刚刚浸没糯米，待温度上升至60℃时以10 U/g的接入量加入耐高温α-淀粉酶，90℃水浴保温2 h，冷却后过滤，加水定容至1 L，分装成50 mL/瓶，115℃条件下高压蒸汽灭菌30 min。

糯米液态发酵培养基：按照50 g/瓶的量，称取糯米加水浸泡4 h后沥干，加水至刚刚浸没糯米，置于水浴锅中，待温度上升至60℃时以10 U/g的接入量加入耐高温α-淀粉酶，90℃保温2 h，冷却后加水定量至200 g/瓶，打浆，115℃条件下高压蒸汽灭菌30 min。

1.2仪器与设备

LS-B35L-I立式压力蒸汽灭菌锅：江阴滨江医疗设备有限公司；SW-CJ-TB标准净化工作台：苏州集团苏州安泰空气技术有限公司；HWY-2112恒温调速摇床柜：上海智诚分析仪器制造有限公司；SGD-IV还原糖测定仪：山东省科学院生物研究所；GC7890-Ⅱ气相色谱仪：上海天美科学仪器有限公司。

1.3方法

1.3.1菌悬液和液态曲的制备

霉菌孢子、酵母菌悬浮液的制备方法见文献［8］。

霉菌液态曲制备：将霉菌孢子悬浮液，按105个/mL接种量接入霉菌种子培养基中，30℃、120 r/min培养32 h即为霉菌液态曲。

1.3.2分析检测方法

（1）理化成分分析

酒精度、总糖、总酸、氨基酸态氮含量的测定参照国标GB/T 13662—2008《黄酒》［9］的方法进行。

（2）风味物质分析

采用气相色谱法（内标法）。气相色谱条件：TM-930白酒专用毛细管柱（25 m×0.53 mm×0.1 μm）；载气为氮气（N2）；采用程序升温：起始温度45℃保持3 min，以3.5℃/min上升至62℃，以1℃/min上升至67℃，再以25℃/min上升至200℃保持6 min；进样口、检测器温度220℃；采样结束时间30 min。内标物为乙酸丁酯，含量为34.17 mg/100 mL。1.3.3混合发酵接种方式

非酿酒酵母SP、3-1Y与酿酒酵母SJ4混合发酵采用顺序接种方式：先分别将粟酒裂殖酵母SP、扣囊复膜酵母3-1Y按1∶1的混合比接入灭菌后的液态糯米发酵培养基中，摇床120 r/min、28℃条件下培养24 h，再以与各非酿酒酵母相同的接种量接入酿酒酵母SJ4（总接种量为106个/mL），摇床120 r/min，28℃的培养条件继续发酵2.7 d，糯米酒中还原糖含量趋于稳定，发酵结束。

1.3.4糯米酒酿造工艺流程

糯米→浸米→高温液化→打浆分装→灭菌→接种霉菌→糖化→接种酵母→酒精发酵→酒醪分离→巴氏灭菌→糯米酒

操作要点：

（1）浸米：常温浸米4 h以上，至米粒能用手指捻碎。（2）高温液化：用60℃温水浸没糯米，以10 U/g的量加入耐高温α-淀粉酶，水浴锅中90～95℃保温2 h。

（3）打浆：按照料水比1∶3（g∶mL）在打浆机中低速打浆5 min。

（4）分装灭菌：以200 g/瓶的量分装糯米浆，115℃蒸汽灭菌30 min。

（5）接种霉菌糖化：将8-3M液态曲全部接入灭菌冷却后的糯米发酵培养基中，30℃、摇床120 r/min糖化36 h。

（6）接种酵母发酵：将酵母菌悬浮液按106个/mL的总接种量接入糖化好的糯米发酵培养基中，28℃、摇床120r/min的条件下发酵。

（7）酒醪分离：4 000 r/min离心糯米酒发酵液5 min。（8）巴氏灭菌：将糯米酒液70℃灭菌30 min后急速冷却至4℃。

1.3.5统计分析

采用Microsoft Excel、Origin、Graphpad Prism 5和主成分分析对实验数据进行统计分析。

2　结果与分析

2.1单一及混合酵母发酵对糯米酒理化性质的影响

表1　单一及混合酵母发酵对糯米酒理化指标的影响Table 1 Effects of single and mixed yeasts fermentation on physicochemical indexes of glutinous rice wine

单一及混合酵母发酵糯米酒的理化指标检测结果见表1。由表1可知，单一和混合酵母发酵糯米酒的理化性质差异显著（P＜0.05）。与SJ4单菌种发酵相比，3-1Y/SJ4（1∶1）与SP/SJ4（1∶1）混合发酵糯米酒的酒精度与之相当，总酸含量却分别提高了11.7%、27.8%，氨基酸态氮含量亦分别提高了19.8%、34.8%，糯米酒中总酸和氨基酸态氮含量的升高标志着糯米酒品质的提高［10-11］。因此酿酒酵母SJ4与非酿酒酵母3-1Y、SP的两两混合（1∶1）发酵，在保证产品酒精度的同时能提升糯米酒的品质。

2.2单一及混合酵母发酵对糖代谢的影响

单一及混合酵母发酵对糯米酒还原糖含量的影响结果见图1。由图1可知，还原糖含量在发酵时间0～9 h，在根霉8-3M的糖化作用下逐渐升高，后来随着酵母对还原糖的吸收和利用又逐渐降低。单一和混合酵母发酵对还原糖的消耗速度差异性显著（P＜0.05），得出不同属酵母在发酵过程中对还原糖的吸收速率不同。

图1　单一及混合酵母发酵对糯米酒还原糖含量的影响Fig.1 Effects of single and mixed yeasts fermentation on reducing sugar content of glutinous rice wine

曲线下面积法可以评价整体的耗糖快慢，残还原糖曲线下面积越小，耗糖越快［12］。单一及混合酵母发酵糯米酒的还原糖变化曲线下面积结果表2。

表2　单一及混合酵母发酵对糯米酒还原糖曲线下面积的影响Table 2 Effects of single and mixed yeasts fermentation on reducing sugar area under curve of glutinous rice wine

由表2可知，AUCSJ4＜AUC3-1Y/SJ4＜AUCSP/SJ4＜AUCSP/3-1Y/SJ4＜AUCSP＜AUC3-1Y，故3种不同属酵母单菌种发酵时，SJ4消耗还原糖的速度最快，其次是粟酒裂殖酵母SP，扣囊复膜酵母3-1Y最慢。当2种非酿酒酵母分别与SJ4混合发酵的耗糖速度与其单菌种发酵时相比明显提高：AUC3-1Y/SJ4与AUC3-1Y相比降低了59.2%，AUCSP/SJ4与AUCSP相比降低了32.9%。但酵母3-1Y/SP/SJ4（1∶1）混合发酵的耗糖速度低于3-1Y/SJ4（1∶1）和SP/SJ4（1∶1）混合发酵，可能是因为2种非酿酒酵母的过度增殖与SJ4产生竞争性抑制作用［13-14］，导致发酵时间延长。3种混菌发酵方式中3-1Y/SJ4（1∶1）混合发酵的AUC值最小为9 371，表明其耗糖快，发酵时间短。结果表明，酿酒酵母SJ4能快速消耗还原糖转变为酒精，具有较强的发酵能力。利用SJ4这种发酵特性将其与非酿酒酵母进行混合发酵，与非酿酒酵母单菌种发酵相比，能够提高发酵过程中还原糖的消耗速率，改善非酿酒酵母单菌种发酵时发酵时间长的问题。

2.3单一及混合酵母发酵对糯米酒风味物质的影响

混标、单一及混合酵母发酵糯米酒样品中10种主要的风味物质在1.3.2的气相条件下进行分析，气相色谱图见图2，各风味物质含量结果见表3。

图2　混标（A）及酵母3-1Y与SJ4混合（1∶1）发酵糯米酒样品（B）的气相色谱图Fig.2 Gas chromatogram of mixed standards（A）and glutinous rice wine sample（B）by yeast 3-1Y：yeast SJ4（1∶1）mixed fermentation

醇、酯类风味物质是酵母在发酵过程中产生的次级代谢产物，对白酒的风味具有重要的影响［15］。由表3可知，SJ4与SP单菌种发酵时甲醇含量依次为（417.4±1.7）mg/L、（99.2±0.6）mg/L，异丁醇含量依次为（321.3±2.3）mg/L、（334.5±3.1）mg/L。甲醇能刺激视神经，含量过高可致人失明，异丁醇能够引起饮用者的头痛，含量过高会影响酒的品质［16］。而酵母3-1Y单菌种发酵时发酵能力弱，糯米酒中不仅酒精度低，高级醇含量也很低。故3种不同属酵母的单菌种发酵均不适用于糯米酒的液态酿造。

与SJ4单菌种发酵相比，混合发酵均能使糯米酒中甲醇含量明显降低，这对改善糯米酒的品质有重要作用。3-1Y/SJ4（1∶1）、SP/SJ4（1∶1）、SP/3-1Y/SJ4（1∶1∶1）混合发酵中高级醇含量降低分别为SJ4单菌种发酵时的7.61%、29.2%、 32%，总酯含量升高是SJ4单菌种发酵的3.47倍、3.21倍、5.95倍。结果表明，混合菌种发酵能使糯米酒中高级醇含量降低、酯类物质含量升高，这对改善糯米酒的风味和口感有重要的意义。

表3　单一及混合酵母发酵对糯米酒中风味物质含量的影响Table 3 Effects of single and mixed yeasts fermentation on flavor compounds contents in glutinous rice wine mg/L

2.4主成分分析法确定最佳酵母组合

主成分分析（PCA）也称主分量分析，该方法利用降维的思想，将多指标的变量通过线性变换、计算特征值等转化成少数几个综合指标的数理统计方法［17］。单一及混合酵母发酵所得糯米酒中的10种风味物质含量，在Minitab15分析软件中运用统计菜单中的主成分分析过程进行分析，得到特征值、贡献率、累计贡献率、载荷图（见图3）和分值图（见图4）。由图3可知，第一分量（PC1）所占比率为48.9%，第二分量（PC2）所占比率为31%，两个分量的累计贡献率为79.9%，故此分析结果可靠；对第一分量影响较大的依次为异丁醇、仲丁醇、正丁醇、乙酸乙酯、己酸乙酯、甲醇，对第二分量影响较大的依次为丁酸乙酯、异戊醇、正丙醇。

图3　单一及混合酵母发酵糯米酒中风味物质载荷图Fig.3 Load diagram of flavor compounds in glutinous rice wine fermented by single and mixed yeasts

图4　单一及混合酵母发酵糯米酒中风味物质分值图Fig.4 Score diagram of flavor compounds in glutinous rice wine fermented by single and mixed yeasts

由图4可知，SJ4、SP、3-1Y三种属酵母混合发酵的PC1值最高为2.821 5，SJ4与3-1Y混合发酵的PC2值最高为2.60369。计算2种发酵方式的相对贡献率（PC1×PC2）大小，SJ4与3-1Y混合发酵的贡献率大于SJ4、SP、3-1Y三种属酵母混合发酵，因此确定SJ4与3-1Y的混合发酵是最佳酵母属组合方式。

2.5不同酵母酿造糯米酒的感官评分

将不同酵母酿造的糯米酒进行感官评价，结果见图5。

由图5可知，不同酵母酿造糯米酒的感官评分由大到小依次为：SJ4/3-1Y＞SJ4/SP/3-1Y＞SJ4＞3-1Y＞SJ4/SP＞SP。其中SP单菌种发酵的糯米酒中因混杂较明显的臭味导致感官评分最低仅为2.3分，3-1Y/SJ4混合发酵酒香气饱满、口味清爽，感官评分最高为7分（满分10分计）。以上结果与主成分分析所得结果基本一致，说明主成分分析法在一定程度上适用于液态发酵糯米酒酵母菌种优选。

图5　单一及混合酵母发酵糯米酒的感官评分Fig.5 Sensory evaluation of glutinous rice wine fermented by single and mixed yeasts

3　结论

本实验对2种非酿酒酵母（扣囊复膜酵母属3-1Y、粟酒裂殖酵母属SP）和酿酒酵母SJ4进行了单一及混合菌种发酵研究。结果表明，不同属酵母之间发酵特性及代谢产物含量差异巨大：酿酒酵母与非酿酒酵母分别有很强的耗糖和产酯能力。酿酒酵母和非酿酒酵母的混合发酵，在保证发酵效率的同时能使糯米酒中酯类物质含量增加，低级醇含量降低。利用主成分分析法（PCA）对单菌种及混合菌种发酵糯米酒的风味物质进行分析，得出酵母3-1Y+SJ4混合发酵的相对贡献值最大为3.448 7，糯米酒中总酸和氨基酸态氮含量有所提高，产品共检测了12种风味物质，总酯含量有增加，甲醇及高级醇有所降低，感官评分为7分（满分10分），最适用于糯米酒的发酵。

通过研究不同属酵母单菌种及混合菌种在液态发酵糯米酒中的发酵特性，并用主成分分析法分析糯米酒中风味物质含量从而优选出最佳酿造菌种，以上研究方法为大规模筛选最佳工业酵母菌株提供参考依据。

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YANG Zilin，WU Shihua，ZHAO Dongling*，HUANG Cuiji，YANG Lifeng
（College of Biological and Chemical Engineering，Guangxi University of Science and Technology，Liuzhou 545006，China）

In order to select excellent yeast strains and improve the taste of glutinous rice wine produced by liquid fermentation，the glutinous rice wine was brewed by single yeast（Sacchromyces cerevisiaeSJ4，Saccharomycopsis fibuligera3-1Y，orSchizosaccharomyces pombeSP）and multi-yeast（S.cerevisiaeSJ4∶S.fibuligera3-1Y（1∶1），S.cerevisiae SJ4：S.pombe SP（1∶1），or S.cerevisiae SJ4∶S.fibuligera3-1Y∶S.pombeSP（1∶1∶1））fermentation method.The flavor compounds and physicochemical indexes of glutinous rice wine were analyzed by area under the curve（AUC）and principle component analysis（PCA）.The results showed that at the mixed fermentation ofS.cerevisiaeSJ4∶S.fibuligera3-1Y∶S.pombeSP（1∶1∶1），the AUC value（9 371）was the least and the relative contribution value（3.448 7）was the largest.The content of total acid and amino acid nitrogen in glutinous rice wine were increased，and 12 kinds of flavor compounds in the wine were detected，the total esters content was increased，methanol and higher alcohols were decreased.The sensory score was 7，which was the most suitable for the glutinous rice wine fermentation.

glutinous rice wine；yeast；selection；principle component analysis；flavor compounds

TS261.1

0254-5071（2016）06-0060-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.06.013

2016-03-09

广西科技攻关项目（桂科攻0782003-2）

杨子琳（1990-），女，硕士研究生，研究方向为代谢控制发酵。

赵东玲（1965-），男，工程师，博士，研究方向为生物工程。