（+）γ-内酰胺酶菌株BH24发酵产酶条件优化

张旭姣，迟乃玉，2，杨丽娜，王晓辉，张庆芳*

（1.大连大学生命科学与技术学院辽宁省海洋微生物工程技术研究中心，辽宁大连116622；2.沈阳农业大学食品学院，辽宁沈阳110866）

（+）γ-内酰胺酶菌株BH24发酵产酶条件优化

张旭姣1，迟乃玉1，2，杨丽娜1，王晓辉1，张庆芳1*

（1.大连大学生命科学与技术学院辽宁省海洋微生物工程技术研究中心，辽宁大连116622；2.沈阳农业大学食品学院，辽宁沈阳110866）

基于单因素试验，通过Plackett-Burman试验设计、最陡爬坡试验设计、中心组合试验设计和响应面分析，对（+）γ-内酰胺酶菌株BH24发酵产酶进行优化。单因素试验结果表明，在碳源为5.0 g/L葡萄糖、氮源为10.0 g/L蛋白胨、温度26.0℃、pH 8.0、接种量4.0%、装液量100 mL/500 mL、转速150 r/min条件下，菌株BH24的生物量、（+）γ-内酰胺酶酶活力及产物e.e.值均有不同程度的提高。响应面优化结果表明，当葡萄糖质量浓度为4.0 g/L，温度为25.2℃，pH值为7.6时，（+）γ-内酰胺酶酶活可达114.5 U/L，比优化前提高了50.7%。

（+）γ-内酰胺酶；发酵条件优化；响应面法

γ-内酰胺酶是催化酰胺类化合物γ-内酰胺酰胺键的一种新型酰胺酶［1］。光学纯的（-）γ-内酰胺是制备抗病毒药物的手性中间体［2］，是抗艾滋病药物（-）阿巴卡韦和（-）卡巴韦的合成原料，也是抗流感药物帕拉米韦的合成原料［3-4］。（+）γ-内酰胺酶能够高效率动力学拆分外消旋体γ-内酰胺，获得光学纯的（-）γ-内酰胺［5］。运用生物酶法进行工业化生产（-）γ-内酰胺，具有反应条件温和，产物光学纯度高，环境友好等优点［4］。此外，在酶催化的基础研究方面，因此类酶的个体一般具有多重的酶催化活性［6-7］，这种多重活力对于研究相关酶的催化机理之间的联系［8］以及这些酶之间的进化关系具有非常重要的科学意义。本研究从环境微生物中分离筛选出一株高产（+）γ-内酰胺酶菌株BH24，为了进一步研究其最优发酵条件，在单因素试验基础上，使用Design-Expert.V8.0.6.1软件，通过Plackett-Burman试验设计，从8个过程变量中筛选出最重要的因素，通过Box-Behnken试验设计对响应过程变量进行数学建模分析，进一步优化响应因子，最终确定最优发酵条件［9-10］，为该（+）γ-内酰胺酶进一步研究奠定基础。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

菌种：筛选自大黑山土壤，鉴定为苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis），命名为菌株BH24。现由大连大学辽宁省海洋微生物工程技术研究中心保藏。

异丙醇、乙腈、正丁醇均为色谱纯，其他试剂为分析纯：天津市科密欧化学试剂有限公司。

菌株初始发酵培养基：酵母膏5.0 g/L，葡萄糖5.0 g/L，KH2PO47.0 g/L，Na2HPO42.0 g/L，MgSO40.4 g/L，FeSO40.02 g/L，CaCl20.02 g/L，NH4Cl 5.0 g/L，调节pH7.0。

1.2仪器与设备

LC-20A型高效液相色谱仪（high performance liquidchromatography，HPLC）：日本岛津公司；CHIRALPAKAS-H（250 mm×4.6 mm）手性色谱柱：日本大赛璐公司。

1.3方法

1.3.1发酵工艺的单因素优化

在初始发酵培养基及发酵条件基础上，通过对培养基的碳源、氮源及培养基的初始pH值、培养温度、接种量、通气量、转速进行考察，最终确定发酵培养基及培养条件。

1.3.2PB试验设计

在单因素摇瓶发酵试验的基础上，将筛选出的影响（+）γ-内酰胺酶菌株BH24发酵因素蛋白胨、葡萄糖、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、硫酸镁、吐温-80、pH值、温度，分别作为PB试验的考察对象，利用Design-Expert.V8.0.6.1软件，选用Plackett-Burman设计，因素与水平见表1。

表1　Plackett-Burman试验因素及水平Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman experiments

1.3.3最陡爬坡试验设计

根据PB试验得到3个最显著因素，对这3个因素进行最陡爬坡试验设计。由PB试验设计的效应评价结果可知，其中两个因素应按一定步长逐渐增大，另一个因素应按一定步长逐渐减小，以寻找最大响应区。

1.3.4中心组合试验设计

将最陡爬坡试验结果中酶活最高的一组作为中心组合试验中心点，确定3因素3水平，运用Design-Expert.V 8.0.6.1软件进行Box-Behnken试验设计。试验因子和编码水平见表2。每组试验重复3次取平均值，运用上述软件分析得到最优结果，并对预测值进行验证。

表2　Box-Behnken试验因素与水平Table 2 Factors and levels of Box-Behnken experiments

1.3.5测定方法

酶活测定方法：取发酵液8 000 r/min离心15 min，得到的湿菌体经0.05 mol/L磷酸钠缓冲液（pH 7.0）洗涤3次，将菌体均匀悬浮于等体积（±）γ-内酰胺质量浓度为10 g/L的缓冲液中（0.05 mol/L，pH 7.0），28℃、150 r/min条件下反应8 h。10 000 r/min离心，取上清液。上清液经正丁醇萃取后，再经有机滤膜过滤制成上样样品，每组试验平行3次。手性HPLC分析上样样品中（±）γ-内酰胺的浓度，并计算发酵液的酶活（U/L）。

酶活定义：在28℃条件下，每分钟水解1 μmol（+）γ-内酰胺所需要的酶量为一个酶活单位（U）。相对酶活力以每组实验中所产酶活力最高为100%。

产物对映体过量（enantiomeric excess，e.e.）值的计算：

式中：C-为（-）γ-内酰胺浓度，mmol/mL；C+为（+）γ-内酰胺

浓度，mmol/mL。

菌体干质量测定方法：取发酵液8000r/min离心15min，离心获得的湿菌经0.05 mol/L磷酸盐缓冲溶液（pH7.0）洗涤3次，65.0℃烘干至质量恒定，计算菌体干质量（g/L），每组试验平行3次。

2　结果与分析

2.1发酵培养基对BH24生长和产酶的影响

2.1.1碳源对菌株BH24生长和产酶的影响

在初始发酵培养基的基础上，分别添加质量浓度为5.0 g/L的可溶性淀粉、柠檬酸、蔗糖、乳糖、麦芽糖替换菌株BH24发酵培养基的碳源，与添加质量浓度为5.0 g/L葡萄糖为碳源进行比较，结果如图1所示。

图1　碳源对菌株BH24菌体生长和发酵产酶的影响Fig.1 Effect of carbon source on cell growth and enzyme production of strain BH24

由图1可知，不同碳源对菌株BH24的生长和酶活有较大的影响。以葡萄糖或麦芽糖为唯一碳源时，菌体干质量、酶活和产物e.e.值均较高，其中葡萄糖在酶活上略有优势。综合考虑菌体干质量、e.e.值和酶活3个指标，选择葡萄糖作为发酵培养基的碳源。

2.1.2葡萄糖添加量对菌株BH24生长和产酶的影响

改变培养基中葡萄糖的质量浓度，其他成分和含量不变，培养获得的菌体进行（±）γ-内酰胺的转化，结果如图2所示。

图2　葡萄糖质量浓度对菌株BH24菌体生长和发酵产酶的影响Fig.2 Effect of glucose content on cell growth and enzyme production of strain BH24

由图2可知，当葡萄糖质量浓度为1.25～5.0g/L时，菌体干质量与酶活均逐渐增大；当质量浓度为5.0g/L时，菌体干质量、酶活和产物e.e.值均达到最大值；当质量浓度＞5.0g/L后，菌体干质量与酶活迅速下降。综合考虑以上因素，故选择葡萄糖质量浓度为5.0 g/L。

2.1.3氮源对菌株BH24生长和产酶的影响

在以葡萄糖为培养基碳源基础上，分别添加质量浓度为5 g/L的蛋白胨、牛肉膏、磷酸氢二铵、氯化铵、尿素替换菌株BH24发酵培养基的氮源，与添加质量浓度为5 g/L酵母膏为氮源进行比较。结果如图3所示。

图3　氮源对菌株BH24菌体生长和发酵产酶的影响Fig.3 Effect of nitrogen source on cell growth and enzyme production of strain BH24

由图3可知，菌株BH24在以3种无机氮源为氮源的培养基中生长情况很差。以牛肉膏或蛋白胨为唯一氮源时，菌体干质量和酶活较高，但对于产物e.e.值，添加牛肉膏为氮源略低于添加蛋白胨；酵母膏为氮源时，菌体生长状况良好，但产物的e.e.值较低。综合考虑以上因素，选择蛋白胨作为氮源，以促进菌体生长产，保证产酶的活性。

2.1.4蛋白胨添加量对菌株BH24生长和产酶的影响

改变培养基中蛋白胨的质量浓度，将培养获得的菌体进行（±）γ-内酰胺的转化，结果如图4所示。

图4　蛋白胨质量浓度对菌株BH24菌体生长和发酵产酶的影响Fig.4 Effect of peptone content on cell growth and enzyme production of strain BH24

由图4可知，当蛋白胨质量浓度为5.0～10.0 g/L时，菌体干质量与酶活均逐渐增大；当质量浓度为10.0 g/L时，菌体干质量、酶活和产物e.e.值均达到最大值；当质量浓度＞10.0 g/L后，菌体干质量与酶活开始下降。综合考虑以上因素，故选择蛋白胨质量浓度为10.0 g/L。

2.1.5发酵温度对菌株BH24生长和产酶的影响

在微生物生长过程中，温度是影响其代谢过程的重要因素，结果如图5所示。

图5　发酵温度对菌株BH24菌体生长和发酵产酶的影响Fig.5 Effect of fermentation temperature on cell growth and enzyme production of strain BH24

由图5可知，当温度低于26℃时，菌体干质量和酶活均随温度的升高而增加，产物的e.e.值随没有明显的变化；当温度为28℃时，菌体干质量达到最大值，但其余指标均大幅下降，32℃时菌体几乎停止生长。由于在26℃时e.e.值和产酶量均达到最大值，综合考虑各因素，确定26℃为最适发酵温度。

2.1.6培养基初始pH值对菌株BH24生长和产酶的影响

在微生物生长过程中，pH是影响其代谢过程的又一重要因素，不仅影响菌体的生长，而且对其代谢中各种酶的活性具有调节作用。在前期试验基础上，改变培养基初始pH值，以pH 8.0时酶活为100%，结果如图6所示。

由图6可知，（+）γ-内酰胺酶酶活和菌体干质量在pH 5.0～8.0范围内逐渐升高，在pH 8.0时达到最高，pH＞8.0后均逐渐降低。综合以上因素，最终确定菌体的最适生长和产酶的初始pH值为8.0。

图6　培养基初始pH对菌株BH24菌体生长和发酵产酶的影响Fig.6 Effect of initial pH on cell growth and enzyme production of strain BH24

2.1.7接种量对菌株BH24生长和产酶的影响

相关研究表明，接种量太小，菌体生长量不足，会导致微生物产酶量下降；接种量太大，会导致发酵初期营养消耗过快和缺乏氧气，影响酶产量，接种量对菌株BH24生长和产酶的影响结果如图7所示。

图7　接种量对菌株BH24菌体生长和发酵产酶的影响Fig.7 Effect of inoculum on cell growth and enzyme production of strain BH24

由图7可知，在接种量为4%时，产物e.e.值和（+）γ-内酰胺酶活达到最大；接种量为6%时虽然菌体干质量达到最大，但其余指标下降较多。综合以上因素，选择最适接种量为4%。

2.1.8装液量对菌株BH24生长和产酶的影响

图8　装液量对菌株BH24菌体生长和发酵产酶的影响Fig.8 Effect of liquid volume on cell growth and enzyme production of strain BH24

由图8可知，装液量对（+）γ-内酰胺酶的发酵具有重要的影响。当装液量为100 mL/500 mL时，生物量和（+）γ-内酰胺酶的活力达到最大，此后随着装液量的增多，酶活与e.e.值逐渐降低。该结果说明（+）γ-内酰胺酶发酵的适宜装液量为100 mL/500 mL。

2.1.9转速对菌株BH24生长和产酶的影响

图9　转速对菌株BH24菌体生长和发酵产酶的影响Fig.9 Effect of rotating speed on cell growth and enzyme production of strain BH24

由图9可知，转速为150 r/min时，e.e.值、菌体干质量和（+）γ-内酰胺酶酶活均达到最大值。随着转速的增大，e.e.值变化不明显。该结果说明（+）γ-内酰胺酶发酵的适宜转速为150 r/min。

2.2Plackett-Burman试验设计及重要因素

PB试验设计及结果见表3，根据表3结果对各因素水平进行效应评价，结果见表4。由表4可知，根据PB试验结果，得到3个对酶活影响最显著因素：葡萄糖添加量、pH值、温度。

表3　Plackett-Burman试验设计与结果Table 3 Design and results of Plackett-Burman experiments

表4　Plackett-Burman试验显著因子分析Table 4 Analysis of significant factors of Plackett-Burman experiments

2.3最陡爬坡试验研究最大响应区域

在PB试验基础上，将葡萄糖和温度的值按照步长依次减小，pH按照步长逐步增大进行最都爬坡试验设计［11］，试验设计和结果见表5。由表5可知，其中的第2组试验，当葡萄糖质量浓度为4.0 g/L，pH值为8.0，温度为26℃时，酶活最大。所以选择以第2组试验作为中心组合试验的中心点，进行中心组合试验设计。

表5　最陡爬坡试验设计及结果Table 5 Design and results of the steepest ascent experiments

2.4Box-Behnken中心组合试验设计结果

2.4.1中心组合设计及结果

运用Design-Expert.V8.6.0.1软件，以酶活（Y）为响应值，对葡萄糖、pH和温度这3个最显著因素进行3因素3水平的中心组合试验设计，设计结果与响应值见表6。

表6　Box-Benhnken试验设计及结果Table 6 Design and results of of Box-Benhnken experiments

2.4.2回归模型建立与方差分析

运用Design-Expert.V8.6.0.1软件对中心组合试验数据进行回归分析、显著性检验和方差分析，结果见表7和表8。得到回归方程：Y=2 109.725X1+10.248 75X2+239.023 75X3-6.6X1X2-43.4X1X3+4.607 5X2X3-1 211.625X12-8.123 75X22-5.08875X32-3358.565。由表7知其自变量X2，X3，X1X3，X2X3，X12，X22，X32显著（P＜0.05）。失拟项表示所用模型与试验的拟合程度，该设计失拟项P值为0.215 7＞0.05，因而无失拟因素存在。回归方程的相关系数R2为0.986 7，校正决定系数R2Adj为0.9628＞0.80，模型变异程度仅为3.72%。说明模型拟合度较好，该回归方程可用于代替试验真实点对试验结果进行初步分析和预测［12］。

表7　回归系数的显著性检验Table 7 Significance testing of regression coefficient

表8　回归方程的方差分析Table 8 Variance analysis of regression equation

2.4.3响应面分析结果

根据响应面法分析绘制出响应曲面图及其等高线图（见图10）。二者直观反映出了葡萄糖质量浓度、温度和pH三者的交互作用对酶活的影响。图10中椭圆形或马鞍形等高线表示参数之间交互作用显著，圆形等高线表示参数之间交互作用不显著［13］。由图10可知：温度和pH水平固定，葡萄糖质量浓度为3.0～4.0 g/L时，（+）γ-内酰胺酶酶活呈增大趋势；葡萄糖质量浓度和温度水平固定，pH在7.0～7.6时，（+）γ-内酰胺酶酶活呈增大趋势；葡萄糖质量浓度和pH水平固定，温度为24～25.2℃时，（+）γ-内酰胺酶酶活呈增大趋势。因此选择葡萄糖质量浓度为4.0 g/L、pH值为7.6、温度为25.2℃进行（+）γ-内酰胺酶菌株的发酵，以提高发酵效率。

图10　葡萄糖浓度、pH值和温度交互作用对酶活影响的响应面和等高线Fig.10 Response surface plots and contour line of effects of interaction between of glucose content，pH and temperature on the yield of CoQ10

2.4.4最优条件的确定与验证

利用Design-Expert.V8.0.6.1软件分析得到最优发酵条件：葡萄糖质量浓度为4.0g/L、温度为25.2℃和pH为7.63，预测（+）γ-内酰胺酶最大酶活为116.9 U/L。根据实际情况，最优发酵条件数值调整为葡萄糖质量浓度4.0 g/L、温度25℃和pH 7.6。在此条件下进行验证试验得到（+）γ-内酰胺酶酶活平均值为114.5 U/L，相对偏差为2.1%。因此采用响应面法对（+）γ-内酰胺酶菌株培养条件进行优化准确可靠［14］。

3　结论

单因素试验结果显示，应选择质量浓度为5.0 g/L的葡萄糖为碳源，质量浓度为10.0g/L的蛋白胨为氮源，温度26℃，pH8.0，接种量4%，装液量100 mL/500 mL，转速150 r/min。在此基础上进行响应面优化，最优的发酵条件为：葡萄糖质量浓度4.0 g/L、温度25℃和pH 7.6。通过培养条件优化，（+）γ-内酰胺酶酶活由优化前的约76.0 U/L提高至114.5 U/L，比优化前提高了约50.7%［15］。

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ZHANG Xujiao1，CHI Naiyu1，2，YANG Lina1，WANG Xiaohui1，ZHANG Qingfang1*
（1.Liaoning Marine Microbial Engineering and Technology Center，College of Life Science and Technology，Dalian University，Dalian 116622，China；2.College of Food Science，Shenyang Agricultural University，Shenyang 110866，China）

Based on single factor experiments，the fermentation conditions of（+）γ-lactamases-producting strain BH24 were optimized by Plackett Burman design，the steepest ascent experiments design，central composite design，and response surface analysis.The results of single factor experiments showed that in the conditions of 5.0 g/L glucose as carbon source，10.0 g/L peptone as the nitrogen source，temperature 26.0℃，pH 8.0，inoculum 4.0%，liquid volume 100 ml/500 ml，rotating speed 150 r/min，the biomass，（+）γ-lactamases activity and e.e.value all were increased in different degrees.The results of response surface optimization showed that the（+）γ-lactamases activity was up to 114.5 U/L in the conditions of glucose content 4.0 g/L，temperature 25.2℃and pH 7.6，which was 50.7%higher than that before optimization

（+）γ-lactamases；fermentation conditions optimization；response surface methodology

Q936

0254-5071（2016）06-0070-06

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.06.015

2016-03-07

国家高技术研究发展计划‘863’计划项目（No.2007AA021306）

张旭姣（1988-），女，硕士研究生，研究方向为微生物资源开发与利用。

张庆芳（1965-），女，教授，博士，研究方向为微生物资源开发与利用。