高产辅酶Q10类球红细菌的化学诱变筛选及其发酵培养基优化

扶教龙，钱大伟，吴晨奇，徐敏强，胡翠英，李良智

（苏州科技大学化学与生物工程学院，江苏苏州215000）

高产辅酶Q10类球红细菌的化学诱变筛选及其发酵培养基优化

扶教龙，钱大伟*，吴晨奇，徐敏强，胡翠英，李良智

（苏州科技大学化学与生物工程学院，江苏苏州215000）

利用菌株对（维生素K3+叠氮化钠+对羟基苯甲酸）的复合抗性作为筛选标记，对产辅酶Q10的类球红细菌（Rhodobacter sphaeroides）使用亚硝基胍进行化学诱变，筛选高产菌株并采用响应面法优化其发酵培养基。结果表明，经诱变选育得到一株遗传稳定的辅酶Q10高产菌株R.sp3-7，其最佳发酵培养基组成为：葡萄糖31.7 g/L，玉米浆干粉5.6 g/L，（NH4）2SO45.3 g/L、谷氨酸钠3.0 g/L、NaCl 3.0 g/L、MgSO4·7H2O 12.5 g/L、KH2PO43.0 g/L、CaCO32.0 g/L、辅液1 mL/L。在此培养条件下，诱变菌株R.sp3-7的辅酶Q10产量达（93.63±0.59）mg/L，与出发菌株相比提高了116.8%。

辅酶Q10；抗性平板；化学诱变；响应面分析方法；类球红细菌

辅酶Q10（coenzyme Q10，CoQ10）广泛存在于高等动物线粒体内膜中的一种内源性物质，是呼吸链的重要递氢体，是生成三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）的必需成分［1］。它具有抗氧化性、清除自由基、提高机体免疫力等功效，可预防和治疗多种疾病，在治疗心脏衰竭、延缓皮肤衰老等方面具有较广泛的应用［2-4］。因此，经济生产CoQ10的途径也变得尤为重要。目前，CoQ10的主要生产方法有：动植物提取法、植物细胞培养法、化学合成法和微生物发酵法。相比其他三种方法，微生物发酵法生产CoQ10具有分离过程相对简单、产品活性好、可规模放大生产能力等优点，成为最有发展潜力的CoQ10生产方法。要实现发酵法工业化生产CoQ10首先要解决的问题是获得一株高产菌株。但是自然筛选获得的菌株产量都很低，需要通过诱变育种、构建工程菌、优化发酵工艺等策略，来最大限度地提高菌株生产CoQ10的能力，以实现CoQ10的工业化生产［5］。

由于CoQ10的生物合成途径比较复杂，涉及到超过20种中间产物和调控相关反应的酶类。目前通过基因工程方法通过改变某一或某几个关键酶基因的表达来提高发酵菌株中CoQ10的含量并实现工业化生产仍存在一定困难，传统的物理化学诱变育种手段仍是获得CoQ10高产菌株的有效方法。郑君等［6］以球形红假单胞菌（Rhodopseudomlonas sphaeroides）1.1737T为出发菌株，经紫外线和亚硝基胍诱变，并结合罗红霉素和对羟基苯甲酸抗性突变株筛选，获得了一株CoQ10产量为50.6 mg/L的高产突变株PHBR-2，较出发菌株产量提高了90.9%。YOSHIDA H等［7］对类球红细菌（Rhodobacter sphaeroides）KY-4113进行NTG诱变筛选耐L-乙硫氨基酪酸的突变株，获得的一株绿色突变株，该株菌可能丧失合成红色类胡萝卜素的能力而表达细菌叶绿素，故在肉汤琼脂培养基上呈绿色菌落，该菌株CoQ10含量比野生株提高20%。

本研究采用超声辅助酸热法对类球红细菌（Rhodobacter sphaeroides）进行CoQ10破壁提取，可实现批量提取菌体中CoQ10。使用紫外-氯化锂（LiCl）、亚硝基胍（nitrosoguanidine，NTG）最佳诱变剂量诱变处理，筛选耐维生素K3（vitamin K3，VK3）、叠氮化钠（NaN3）、对羟基苯甲酸（para hydroxy benzoic acid，PHBA）等前体物质的CoQ10生产菌株。经过摇瓶发酵初筛、复筛获得CoQ10高产菌株，并使用单因素与响应面法结合进一步对其发酵培养基组分进行优化［8-10］，以进一步提高CoQ10产量，为CoQ10在国内的工业化生产奠定一定的科学基础。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

1.1.1菌种

类球红细菌（Rhodobacter sphaeroides）：由浙江大学于洪巍教授赠送。

1.1.2培养基

种子培养基：葡萄糖3 g/L，酵母提取物8 g/L，NaCl 2 g/L，KH2PO41.3 g/L，MgSO4·7H2O 0.25 g/L，1 mL/L辅液；用NaOH调pH至7.2。121℃灭菌20 min。

发酵培养基：葡萄糖40g/L，玉米浆干粉3g/L，谷氨酸钠3 g/L，NaCl 3 g/L，硫酸铵3 g/L，KH2PO43 g/L，MgSO4·7H2O 12.5 g/L，CaCO32 g/L，1 mL/L辅液；用NaOH调pH至7.2。121℃灭菌20 min。

辅液：盐酸硫胺1 g/L，生物素0.015 g/L，烟酸1 g/L［11］。

1.1.3化学试剂

对羟基苯甲酸、氯化锂、亚硝基胍、维生素K3、叠氮化钠、CoQ10标准品，甲醇、乙醇（色谱纯）：阿拉丁试剂（上海）有限公司；葡萄糖、酵母提取物、琼脂粉、氯化钠、磷酸二氢钾、MgSO4·7H2O、盐酸硫胺、生物素、烟酸、NaOH、谷氨酸钠、硫酸铵、CaCO3、无水乙醇、乙酸乙酯：国药集团化学试剂有限公司；玉米浆干粉：上海缘肽生物有限公司。

1.2仪器与设备

LC-20AT高效液相色谱：日本岛津企业管理（中国）有限公司；UNE500灭菌烘箱：德国MEMMERT公司；SW-CJ-2FD超净台：苏州净化设备有限公司；TS-2102型摇床：上海天呈科技有限公司；GHP隔水式恒温培养箱：上海精宏实验设备有限公司。

1.3实验方法

1.3.1菌种活化和种子培养液的制备

将甘油管保存的菌种稀释涂布到基础平板培养基上，32℃条件下静置培养7 d；待菌落生长成熟后，挑起平板上单个菌落接入种子培养基，于32℃条件下200 r/min振荡培养24 h。装液量均为50 mL/250 mL。

1.3.2发酵培养

取种子培养液以8%（V/V）接种量接入发酵培养基，于32℃条件下200 r/min振荡培养72 h。

1.3.3CoQ10的超声辅助酸热破壁提取

取发酵液1 mL，加入200 μL 0.02 mol/L HCl，70℃、500 W超声水浴处理15 min。5 000 r/min离心10 min，弃尽上清。加入5 mL提取液（乙酸乙酯∶乙醇=5∶3，V/V），混匀后置于超声波清洗仪中超声提取10 min，暗室中抽提15 min，每隔5 min摇匀一次。将抽提液10 000 r/min离心10 min，得CoQ10提取液［12］。

1.3.4CoQ10含量的测定

采用高效液相色谱（high-performance liquid chromatography，HPLC）法进行CoQ10含量的测定。HPLC色谱条件：Agilent TC-C18色谱柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流动相为甲醇∶异丙醇=3∶1（V/V）；柱温40℃；检测波长275 nm；流速1 mL/min；进样量20 μL。

CoQ10标准曲线的制作：称取10 mg的CoQ10标准品溶于50 mL的无水乙醇中，得200 mg/L的CoQ10母液，以此母液出发分别稀释至质量浓度分别为40 mg/L、80 mg/L、120 mg/L和160 mg/L的标准溶液。通过HPLC分析获得CoQ10各标准液质量浓度对应的峰面积，并建立CoQ10质量浓度与峰面积之间的关系曲线。按照CoQ10标准曲线回归方程计算发酵液中CoQ10的含量。

1.3.5诱变方法

（1）菌悬液的制备

取10 mL对数生长期的类球红细菌种子培养液，5 000 r/min离心10 min，弃上清，用无菌生理盐水洗涤两次，重新悬浮10 mL生理盐水中，即得菌悬液。

（2）抗性浓度确定

将稀释后菌悬液分别涂布在含有不同质量浓度叠氮化钠（NaN3）、对羟基苯甲酸（PHBA）、维生素K3（VK3）和空白的平板培养基中，32℃条件下，培养5 d，观察菌落生长情况。

（3）化学诱变方法

取1 mL质量浓度为5 mg/mL的亚硝基胍母液加入9 mL菌悬液中，调节终质量浓度为0.5 mg/mL，30℃恒温水浴振荡处理10 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60 min后，离心终止反应，稀释涂布到平板培养基中，后置于32℃避光培养5 d培养，计算活菌数，绘制致死率曲线。致死率计算公式如下：

1.3.6菌株的筛选

（1）初筛

将经过NTG诱变处理30 min后的菌悬液，涂布到含有一定浓度NaN3、PHBA、VK3的平板培养基中，待菌落生长成熟后，从诱变后的平板中挑取颜色变化（除红色以外的菌株）［14-15］或者平板中相对较大且红的单菌落，接入斜面培养基中，斜面培养。

（2）复筛

将初筛得到的菌株逐个进行摇瓶发酵培养，测定其CoQ10产量。

（3）突变菌株的遗传稳定性

将突变株R.sp3-7进行传代培养，传代5次，测定其CoQ10产量（每代重复3次），验证高产菌株的稳定性。

1.3.7发酵培养基配方优化设计

单因素试验：选择葡萄糖质量浓度为25 g/L、30 g/L、35 g/L、40 g/L、45 g/L，选择玉米浆干粉质量浓度为3 g/L、4g/L、5g/L、6g/L、7g/L，选择硫酸铵质量浓度为3g/L、4g/L、5 g/L、6 g/L、7 g/L，分别考察葡萄糖、玉米浆干粉及硫酸铵添加量对诱变菌株发酵产CoQ10的影响［16］。

中心组合设计试验：根据单因素试验结果选用葡萄糖（X1）、玉米浆干粉（X2）及硫酸铵（X3）添加量为考察因素，以CoQ10产量（Y）为响应值，采用Box-Behnken中心组合试验设计3因素3水平的响应面分析及验证试验，最终获得最佳培养基配方［17-18］。响应面试验因素与水平见表1。

表1　响应面试验因素与水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments g/L

2　结果与分析

2.1CoQ10标准曲线的建立

以CoQ10质量浓度（x）为横坐标，峰面积（y）为纵坐标，绘制CoQ10标准曲线，结果见图1。由图1可知，CoQ10标准曲线回归方程为y=0.067 29x，相关系数R2为0.999 96，说明二者线性关系良好［13］。

图1　辅酶Q10的标准曲线Fig.1 Standard curve of CoQ10

2.2诱变筛选结果

2.2.1抗性平板中VK3、NaN3、PHBA浓度的确定

维生素K3是的结构类似物，作为抗性筛选，可以筛选到突破生物合成中的底物质量浓度反馈抑制的突变株。不同质量浓度维生素K3条件下类球红细菌出发菌株的生长状况，结果见表2。由表2可知，维生素K3质量浓度达到10 mg/L时没有菌落生长，将其作为最低抑菌浓度。

表2　维生素K3最低抑菌浓度的确定Table 2 Determination of minimum inhibitory concentration of vitamin K3

叠氮化钠具有阻断电子传递链中电子从细胞色素氧化酶到氧分子间的传递，所以将其作为抗性筛选。不同质量浓度对羟基苯甲酸条件下，类球红细菌出发菌株的生长状况，结果见表3。由表3可知，对羟基苯甲酸质量浓度达到10 mg/L时没有菌落生长，将其作为最低抑菌浓度。

表3　叠氮化钠最低抑菌浓度的确定Table 3 Determination of minimum inhibitory concentration of NaN3

对羟基苯甲酸是CoQ10生物合成中的前体物质，作为抗性因素，既可以增加CoQ10的合成量，又有可能筛选到解除自身前体物的抑制突变株。不同质量浓度对羟基苯甲酸条件下类球红细菌出发菌株的生长状况，结果见表4。由表4可知，对羟基苯甲酸质量浓度达到0.5 g/L时没有菌落生长，将其作为最低抑菌浓度。

表4　对羟基苯甲酸最低抑菌浓度的确定Table 4 Determination of minimum inhibitory concentration of p-hydroxybenzoie acid

2.2.2亚硝基胍诱变剂量的选择

图2　类球红细菌的NTG诱变致死率Fig.2 Fatality rate ofR.sphaeroides by NTG mutagenesis

NTG为高效诱变剂，能在较低的致死剂量下得到较高的突变率。实验确定NTG的作用浓度为0.5 mg/mL，分别对出发菌株诱变处理10 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60 min后，通过测定不同剂量下的菌体活菌数，绘制亚硝基胍诱变致死率曲线见图2。由图2可知，随着NTG诱变时间延长，类球红细菌致死率逐步升高至100%。因此，选择致死率在80%的作用时间30 min作为最佳诱变剂量，对菌悬液进行诱变处理。

2.2.3高产诱变菌株的筛选

对菌悬液以最佳诱变剂量诱变，涂布到同时含有VK3、NaN3和PHB的平板上，从筛选平板上挑取50株生长良好的单菌落进行初筛和复筛，测定CoQ10产量，筛选结果见图3。前16株是颜色变化的菌株，其中1～4为黄色，5～7为白色，8～16为粉色；17～50为红色。对比筛选的各株菌发现，颜色变化的菌CoQ10产量变化幅度较大，且负突变较多，大多数产量远低于出发菌的产量，但易获得提高幅度较大的CoQ10生产菌株。其中粉色应是类球红细菌退化后的菌，产量普遍偏低，筛选时可避开。而平板中相对其他菌落，较大且红的菌变化幅度虽然不大，但正突变率较大。经筛选选取3株产量较高的菌株（7号、25号、31号三株菌株）斜面甘油管保藏并进行摇瓶复筛，最终选取7号菌株进行后续研究。其是一株白色突变菌株R.sp3-7，CoQ10产量为71.23mg/L，与出发菌株（43.19 mg/L）相比提高了64.92%。该株菌可能丧失合成红色类胡萝卜素的能力。

图3　化学诱变筛选结果Fig.3 Screening results of chemical mutagenesis

2.2.4突变菌株的遗传稳定性

表5　菌株R.sp3-7的遗传稳定性Table 5 Genetic stability of strain R.sp3-7

为了验证高产菌株的稳定性，在实验中将突变株R.sp3-7在斜面上连续传代，每代均进行液体发酵，传代10次，测定其CoQ10产量（每代重复3次），结果见表5。由表5可知，菌体产量较高，波动小，遗传稳定性好。经过多轮选育，菌落形态较单一。因此，菌株R.sp3-7可作为后续实验的研究和工业应用。

2.3发酵培养基优化

2.3.1单因素试验

（1）葡萄糖质量浓度对CoQ10产量的影响

培养基中葡萄糖质量浓度对发酵生产CoQ10的影响，结果见图4。由图4可知，葡萄糖质量浓度达到30 g/L时，CoQ10产量达到最大，可以达到（83.39±0.48）mg/L，进一步提高葡萄糖质量浓度则会对CoQ10积累产生一定的抑制作用。故选择葡萄糖最佳质量浓度为30 g/L。

图4　葡萄糖质量浓度对辅酶Q10产量的影响Fig.4 Effect of glucose content on the yield of CoQ10

（2）玉米浆干粉质量浓度对CoQ10产量的影响

培养基中玉米浆干粉质量浓度对发酵生产CoQ10的影响，结果见图5。

图5　玉米浆干粉质量浓度对辅酶Q10产量的影响Fig.5 Effect of corn steep powder content on the yield of CoQ10

由图5可知，当玉米浆干粉质量浓度3～6 g/L时，CoQ10产量不断增加，并在玉米浆干粉质量浓度为6g/L时，CoQ10产量达到最大值（82.23±0.58）mg/L，进一步提高玉米浆干粉的质量浓度则不利于CoQ10产量的积累。故选择玉米浆干粉质量浓度为6 g/L。

（3）硫酸铵质量浓度对CoQ10产量的影响

培养基中硫酸铵质量浓度对发酵生产CoQ10的影响，结果见图6。由图6可知，当硫酸铵质量浓度为5 g/L时，CoQ10产量达到最大值（80.43±0.46）mg/L，继续增加硫酸铵质量浓度，CoQ10产量反而降低，这表明过多的硫酸铵并不利于CoQ10的形成。这可能是由于硫酸铵为无机氮源，而发酵液里已有有机氮源，过多的NH4+不利于菌体生长和CoQ10合成。故选择硫酸铵的最佳质量浓度为5 g/L。

图6　硫酸铵质量浓度对辅酶Q10产量的影响Fig.6 Effect of（NH4）2SO4content on the yield of CoQ10

2.3.2响应面优化提取条件

（1）模型的建立及显著性检验

根据单因素试验的结果，参照Box-Behnken试验方案，对葡萄糖（X1）、玉米浆干粉（X2）、硫酸铵（X3）质量浓度3个因素进行响应面试验优化，结果见表6。

表6　响应面试验设计及结果Table 6 Design and results of Box-Behnken experiments

用Design-Expert V8.0.6软件，对表6进行多元回归拟合，可以得到CoQ10产量（Y）对葡萄糖（X1）、玉米浆干粉（X2）、硫酸铵（X3）的回归方程为：Y=-609.378 50+23.742 80X1+ 54.65983X2+65.30725X3-9.53333E-003X1X2+2.19020X1X3-4.352 67X2X3-0.558 71X12-2.765 22X22-10.319 75X32。对试验结果进行显著性检验及方差分析，结果见表7。

表7　回归模型方差分析Table 7 Variance analysis of regression model

由表7可知，方差模型显著性P值为0.000 9＜0.05，表明该模型是显著的，方程拟合度较好；同时失拟项的P值为0.072 2＞0.05，说明模型失拟不显著，残差由随机误差引起，模型有效；该方程决定系数R2=0.980 5，说明方程的拟合程度较好，该模型能较好地预测发酵培养基组分与CoQ10产量的关系；校正决定系数R2Adj=0.945 4，表明方程模型可信度较高，能够较好地描述试验结果［19］。

（2）响应面优化及分析

根据BB试验设计结果做出三维响应面，结果见图7。由图7可知，该方程的抛物线图形开口均向下，说明方程存在最大值，即响应面范围覆盖了最大值所在的区域。当葡萄糖质量浓度一定时，CoQ10产量随着玉米浆干粉质量浓度增加而增大，但当玉米浆干粉质量浓度＞5.63 g/L时，CoQ10产量呈下降趋势。当玉米浆干粉质量浓度一定时，随着葡萄糖质量浓度的增加，CoQ10产量也随之增大，但当葡萄糖质量浓度继续增大时，CoQ10产量逐渐降低。等高线的形状可以反映因素间交互作用的强弱，圆形表示交互作用不显著，椭圆形表示交互作用显著。结果表明，葡萄糖与玉米浆干粉交互作用不显著，而葡萄糖与硫酸铵和玉米浆干粉与硫酸铵交互作用显著［20］。

通过Design-Expert软件，进行分析计算，可得最佳发酵培养基配方为：葡萄糖31.66 g/L、玉米浆干粉5.63 g/L，（NH4）2SO45.34 g/L，在此条件下，CoQ10产量的预测最大值为94.57 mg/L。考虑到实际培养基的配制，最终确定这3个因素的质量浓度分别为：葡萄糖31.7 g/L、玉米浆干粉5.6 g/L、（NH4）2SO45.3 g/L。

图7　葡萄糖、玉米浆干粉和硫酸铵质量浓度交互作用对辅酶Q10产量影响的响应面和等高线Fig.7 Response surface plots and contour line of effects of interaction between of glucose，corn steep powder and（NH4）2SO4content on the yield of CoQ10

（3）优化培养基的验证

为了验证试验结果的可靠性，按上述最终培养基参数进行验证试验，3次重复实验的CoQ10产量分别为94.41 mg/L、93.53 mg/L、92.96 mg/L，平均值为（93.63±0.59）mg/L，与预测值只相差1%，表明此模型是可行有效的，能够较好的描述试验结果。

3　结论

本试验采用NTG化学诱变，结合VK3+NaN3+PHBA三种抗性的代谢控制育种方法，考察了不同颜色突变株生产CoQ10的产量变化情况。筛选获得一株CoQ10高产白色诱变菌株R.sp3-7，其CoQ10产量为71.23 mg/L，遗传稳定性良好，比出发菌株提高了64.922%。在单因素试验的基础上，采用BB试验设计，对其发酵培养基进行了优化，通过响应面法对试验数据进行优化与评价，得到影响CoQ10产量的二次多项式回归模型，并对该模型进行显著性检验。最终得到优化的培养基为：葡萄糖31.7 g/L，玉米浆干粉5.6 g/L，（NH4）2SO45.3 g/L，MgSO4·7H2O 12.5 g/L，谷氨酸钠3 g/L，NaCl 3 g/L，KH2PO43 g/L，CaCO32 g/L，辅液1 mL/L。在此条件下，测得CoQ10产量为（93.63±0.59）mg/L，与预测值（94.57 mg/L）相差不大。因此，采用响应面法优化类球红细菌培养基组成稳定可行。综上所述，代谢控制育种方法和响应面法优化培养基都为后续进一步深入研究打下了良好的基础。同时，也可为其他菌种的选育提供一定参考借鉴。

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FU Jiaolong，QIAN Dawei*，WU Chenqi，XU Minqiang，HU Cuiying，LI Liangzhi
（School of Chemical and Biological Engineering，Suzhou University of Science and Technology，Suzhou 215009，China）

Using multiple resistance of vitamin K3，NaN3and p-hydroxybenzoie acid（PHBA）as selective marker，CoQ10-producingRhodobacter sphaeroideswas mutated by nitrosoguanidine（NTG），and the high CoQ10-producing strains was screened.The fermentation medium was optimized by response surface methodology.Results showed that a strain R.sp3-7 with genetic stability and high CoQ10-production was obtained by mutation breeding.The optimum component of fermentation medium was glucose 31.7 g/L，corn steep powder 5.6 g/L，（NH4）2SO45.3 g/L，sodium glutamate 3.0 g/L，NaCl 3.0 g/L，MgSO4·7H2O 12.5 g/L，KH2PO43.0 g/L，CaCO32.0 g/L and auxiliary fluids 1 ml/L.Under the conditions，the yield of CoQ10produced by mutant strain R.sp3-7 was up to（93.63±0.59）mg/L，which was increased by 116.8%than that produced by original strain.

CoQ10；resistant plate；chemical mutagenesis；response surface methodology；Rhodobacter sphaeroides

TS201.3

0254-5071（2016）06-0090-06

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.06.019

2016-03-27

苏州市科技计划项目（sYN201317）；苏州科技学院科研基金项目（XKZ201411）

扶教龙（1969-），男，副教授，博士，研究方向为生物化工、发酵工程。

钱大伟（1991-），男，硕士研究生，研究方向为生物化工、微生物育种。