兰州百合多糖硫酸酯的制备及其抗氧化活性的测定

黄玉龙，赵保堂，宋珅，李伟绮，庞中存，张继*

（1.甘肃省农业科学院农产品贮藏加工研究所，甘肃兰州730070；2.西北师范大学生命科学学院，甘肃兰州730070；3.甘肃省特色植物有效成分制品工程技术研究中心，甘肃兰州730070）

兰州百合多糖硫酸酯的制备及其抗氧化活性的测定

黄玉龙1，2，3，赵保堂2，3，宋珅2，3，李伟绮1，庞中存1，张继2，3*

（1.甘肃省农业科学院农产品贮藏加工研究所，甘肃兰州730070；2.西北师范大学生命科学学院，甘肃兰州730070；3.甘肃省特色植物有效成分制品工程技术研究中心，甘肃兰州730070）

从兰州百合鳞茎中提取百合多糖（LPs），用氯磺酸-吡啶法制备百合多糖硫酸酯（LPsS）。以百合多糖硫酸酯的硫含量为评价指标，依据响应面设计对反应温度、时间和酯化剂比例（氯磺酸∶吡啶）三个影响因素进行优化。得出最佳条件为反应时间1.5 h，反应温度43℃，氯磺酸与吡啶的体积比为1∶1。在此条件下，百合多糖硫酸酯中硫含量可达到10.98%。傅里叶红外光谱扫描显示在波数1 236 cm-1、813 cm-1处出现新吸收峰，说明百合多糖已被硫酸化。气质联用（GC-MS）分析百合多糖硫酸酯由甘露糖、葡萄糖、半乳糖3种单糖组成，其摩尔比为18：14：1。体外抗氧化活性试验结果表明百合多糖硫酸酯具有较好的清除DPPH自由基能力，并且抗氧化活性比未酯化前有所提高。

兰州百合；多糖；硫酸酯化；抗氧化活性

兰州百合（Lilium davidii）是百合科（Liliaceae）百合属（Lilium）川百合的一个变种，始载于《神农本草经》，列为中品，以后历代本草均有记载［1］。兰州百合含有蛋白质、多种维生素、总类胡萝卜素、8种人体必需氨基酸和12种人体必需微量元素等成分［2］，其中总糖含量占13%，现代药理学研究发现，百合多糖（Lilium davidiipolysaccharides，LPs）具有清除自由基、调节免疫、抗肿瘤、抗疲劳、抑菌等作用［3］。近年来对百合多糖的可能作用机制、提取条件优化、分离纯化方面研究较多，但对其构效关系和生理活性机理的研究还不够深入。

多糖分子修饰或功能化可提高其生物活性与生物相容性。多糖硫酸化修饰是用硫酸基团取代大分子链糖基单元的羟基，形成半合成酸性多糖，导致其物理化学性质和空间结构形貌发生改变，使某些活性较低或不具活性的多糖产生新活性［4］。如小分子质量的牛膝多糖具有增强免疫力作用而无抗病毒活性，在引入一定量的硫酸基团后，其抗乙肝病毒的活性增强；香菇多糖经硫酸化修饰后，其人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）的活性也明显增强［5-6］。研究百合多糖构效关系，对其进行结构修饰，有利于百合多糖的抗氧化、抗突变、抗病毒等药理活性的增强［7-8］。

本研究采用氯磺酸-吡啶修饰工艺，对百合多糖进行修饰，制备百合多糖硫酸酯（Lilium davidiipolysaccharides sulfate，LPsS），采用气质联用（gas-chromatograph-mass spectrometry，GC-MS）仪分析其单糖组成，并初步测定了其抗氧化活性，以期为兰州百合高活性多糖的制备及其在食品医药行业的开发应用提供理论依据。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

兰州百合：兰州金德百合商贸有限公司。

吡啶：天津市大茂化学试剂厂；氯磺酸、乙酸酐、无水乙醇：天津光复精细化工公司；甲酰胺、二甲基甲酰胺：天津市化学试剂一厂；三氟乙酸：上海晶纯试剂公司；溴化钾：Adamas试剂公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚（butylated hydroxytoluene，BHT）：美国Sigma公司；标准单糖鼠李糖、来苏糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖：北京索莱宝公司。所有试剂均为分析纯。

1.2仪器与设备

DF-101B恒温磁力搅拌器：浙江乐清市乐成电器厂；JRA-6型恒温水浴锅：金坛市杰瑞尔电器公司；BSA224S型电子天平：德国赛多利斯公司；LGJ-18S冷冻干燥机：北京松源华兴公司；EA3000型元素分析仪：意大利Euro Vector公司；Nicolet iS10傅里叶红外光谱（Fourier transforminfrared spectrum，FT-IR）仪、Polaris-Q气相色谱质谱联用仪：美国Thermo Fisher Scientific公司。

1.3试验方法

1.3.1LPs的制备［9］

称取适量的兰州百合，干燥后经100目筛粉碎，在50℃条件下超声波辅助提取，抽滤后将滤液4 000 r/min离心15 min取上清，减压浓缩，采用Sevage法脱蛋白，加入4倍体积无水乙醇沉淀24 h，4 000 r/min离心15 min，沉淀于-60℃冷冻干燥得到兰州百合多糖。

1.3.2兰州百合硫酸酯化多糖（LPsS）的制备

影响氯磺酸-吡啶方法制备LPsS的主要因素包括氯磺酸（chlorosulfonic acid，CSA）与吡啶（pyridine，Py）体积比、反应温度及反应时间［10］。以硫含量（Y）为响应值，利用Box-Behnken设计了3因素3水平试验，各Box-Behnken试验因素与水平见表1。

表1　Box-Behnken试验因素和水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiments

1.3.3硫含量测定

在氧化炉温度980℃，载气流速125 mL/min，载气压力80kPa，热导检测器与色谱柱温度115℃，氧气压力50 kPa，加氧量20 mL条件下，分析时间320 s，采用元素分析仪测定硫含量（%）［11］。

1.3.4LPsS的FT-IR分析

将干燥充分的多糖样品加溴化钾（KBr）进行压片，在400～4 000 cm-1波数范围用红外光谱仪扫描16次，分辨率为4 cm-1。

1.3.5LPsS的GC-MS分析

称取10 mg LPsS加入4 mol/L三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA）4 mL，120℃条件下氮气保护水解10 h后减压蒸馏，去除三氟乙酸。添加0.5 mL吡啶及10 mg的盐酸羟胺在90℃条件下反应0.5 h，待冷却后再加入500 μL的乙酸酐，90℃条件下乙酰化反应0.5 h，减压蒸干。

反应物经氯仿萃取，0.22 μm微孔滤膜过滤，进行GC-MS分析。

气相色谱（GC）条件：TR-5ms SQC色谱柱（30 m× 0.25 mm×0.25 μm），升温条件为：从120℃（保持3 min）开始，以5℃/min升温至250℃保持5 min。载气为高纯氦气（He），柱流量为1.0 mL/min，分流比为1∶50，进样口温度250℃［12］，进样量0.2 μL。

质谱（MS）条件：电离方式为电子电离（electron ionization，EI）源，电子能量70 eV，离子源温度250℃，四极杆150℃，扫描质量范围为33～550 m/z，无溶剂延迟。

标准单糖和标品处理方法和色谱条件同上。

1.3.6LPs和LPsS对DPPH自由基清除能力的测定［13］

用蒸馏水分别准确配制质量浓度为5.0 mg/mL的LPs和LPsS溶液，使其溶解充分，并各自分别稀释为0.2 mg/mL、0.4 mg/mL、0.6 mg/mL、0.8 mg/mL、1.0 mg/mL、1.2 mg/mL的溶液。配制DPPH溶液浓度为0.2 mmol/L。以丁基羟基甲苯（butylated hydroxytoluene，BHT）溶液作为阳性对照，其质量浓度与多糖溶液系列质量浓度相同。

以上配制的LPs、LPsS和BHT溶液分别量取2 mL，加入DPPH溶液0.5 mL后混匀，置于暗处0.5 h，在波长517 nm处以蒸馏水为对照测定吸光度值Ai。量取不同质量浓度的LPs、LPsS和BHT溶液各2 mL，分别与相对应的溶剂各0.5 mL混合均匀后，在波长517 nm处以蒸馏水为对照测定吸光度值Aj。量取DPPH溶液和蒸馏水各0.5 mL混合，在波长517 nm处以蒸馏水为对照测定吸光度值A0。DPPH自由基清除率计算公式如下：

2　结果与分析

2.1兰州百合多糖硫酸化修饰的单因素试验

2.1.1反应时间对百合多糖硫酸酯硫含量的影响

在反应温度为40℃，CSA/Py 1∶1（V/V）的条件下，考察反应时间（0.5 h、1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h、3.0 h）对LPsS硫含量的影响，结果见图1。

图1　硫含量随反应时间的影响变化Fig.1 Effect of reaction time on the sulfur content

由图1可知，在反应时间0.5～1.5 h的范围内，硫酸化反应时间与LPsS硫含量呈正相关；当反应时间为1.5 h时，硫含量最高，为10.22%；当反应时间＞1.5 h之后，随着反应时间的延长，硫含量开始下降，该现象主要归因于多糖与酯化试剂形成的多糖硫酸酯长时间在酸性环境中所发生的水解与多糖自身的降解［14］。因此，优化反应时间为1.5 h。

2.1.2反应温度对百合多糖硫酸酯硫含量的影响

在反应时间为1.5 h、CSA/Py 1∶1（V/V）时，考察反应温度（30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃）对LPsS硫含量的影响，结果见图2。

图2　硫含量随反应温度的影响变化Fig.2 Effect of reaction temperature on the sulfur content

由图2可知，硫含量在反应温度30～40℃范围内迅速升高；当反应温度为40℃时，硫含量最高，为10.76%；当反应温度＞40℃时，硫含量开始降低。这个结果表明，硫酸化反应宜在一个相对温和条件下进行［15］。因此，选择40℃作为最适反应温度。

2.1.3氯磺酸与吡啶配比对百合多糖硫酸酯硫含量的影响

在反应时间为1.5 h、反应温度为40℃的条件下，考察CSA/Py（1∶3、1∶2、1∶1、3∶2、2∶1、3∶1）体积比对LPsS硫含量的影响，结果见图3。

图3　硫含量随酯化剂配比的影响变化Fig.3 Effect of esterification reagent ratio on the sulfur content

由图3可知，在CSA/Py为1∶3～1∶1（V/V）变化时，硫含量迅速升高；当CSA/Py为1∶1（V/V）时，LPsS硫含量最高，为10.45%；在CSA/Py为1∶1～3∶1（V/V）时，硫含量显著下降。这是由于氯磺酸含量过高，反应体系处于强酸性条件下易产生板结，导致反应不均匀，降低硫酸化效果［16］。因此，选择CSA/Py1∶1（V/V）为最佳。

2.2LPsS制备工艺的响应面法优化

2.2.1响应面法试验结果

通过Box-Benhnhen试验设计，对影响LPsS中硫含量（Y）的酯化剂配比（CSA/Py）、反应温度和时间3个因素进行回归分析，Box-Benhnhen试验结果见表2。

表2　Box-Benhnhen试验结果Table 2 Results of Box-Benhnhen experiments

2.2.2模型建立与方差分析

对表2的数据采用SAS分析软件处理，得出回归模型方程：Y=10.96+0.26X1+0.57X2+0.18X3+0.51X1X2-0.26X1X3+ 0.25X2X3-3.19X12-1.36X22-0.94X32，方差分析结果见表3。

表3　回归模型的方差分析结果Table 3 Variance analysis results of regression model

由表3可知，作用温度X2与二次项X12、X22、X32都极其显著（P＜0.01）；作用时间X1、酯化试剂比例X3及交互项X1X2、X2X3达到显著水平（P＜0.05）。模型的复相关系数R2为0.995 7，说明模型拟合程度良好，试验误差小，该模型适合于模拟LPsS的硫含量。

2.2.3提取条件的响应面分析与优化

根据LPsS硫含量模型作出的响应面见图4。

由图4A可知，当CSA/Py为1∶1（V/V）时，LPsS硫含量随反应温度、反应时间的变化而变化。然而当温度升高到一个临界值时，硫含量开始缓慢减小。这和多糖硫酸酯的合成与水解有关，低温不利于酯化反应进行，而高温又会导致酯的水解，因此选择一个适合的温度，对于多糖硫酸化反应极为重要。由图4B可知，LPsS硫含量随反应时间的延长呈现出先增后减的趋势，在特定的时间内，硫含量不会随温度的升高而增大，反应时间延长虽然有利于酯化，但强酸性条件下酯化时间过长，会使部分多糖水解；反应中CSA的含量少，酯化不完全，导致硫酸化多糖中的硫含量低。由图4C可知，随着反应温度逐渐升高，酯化反应进一步增加，与此同时多糖的降解也随温度升高而加剧，因此，温度过高、酸性太强均不利于LPsS的酯化反应进行。

图4　CSA/Py、反应温度及反应时间对百合多糖硫酸酯的硫含量影响的响应面及等高线Fig.4 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between esterifying reagent ratio，reaction temperature and time on sulfur content of LPsS

2.2.4参数优化和模型验证

从回归模型的数学分析结果中得出的LPs硫酸化最优条件为：酯化剂（CSA/Py）体积比1∶1.07、反应温度43.28℃、反应时间1.53h，硫含量预测值可达11.032%。采用最优工艺条件进行，考虑在实际生产和操作中的方便快捷，在验证最佳参数的试验中将参数值修订为：酯化剂（CSA/Py）体积比1∶1、反应温度43℃、反应时间1.5 h，重复3次，该条件下LPsS硫含量达到（10.98%±0.216）%，与预测值接近。所以该方案优化的LPsS制备最佳工艺参数具有应用参考价值。

2.3兰州百合多糖硫酸酯的红外光谱扫描

LPs和LPsS的红外光谱扫描结果见图5。

由图5可知，LPs在波数为3426.38cm-1处为O-H伸缩振动，波数为1 053.14 cm-1处为一级O-H的变角振动，波数为2916.75cm-1为亚甲基的C-H伸缩振动。LPsS图谱显示其多糖特征吸收未发生变化，而在波数为813 cm-1和1 236 cm-1处出现了新吸收峰。其中，波数为813 cm-1为C-O-S的伸缩振动，波数为1236cm-1为S=O的不对称伸缩振动。另外，波数为2 927 cm-1处C-H吸收峰减弱，说明LPsS的-OH在一定程度上被取代。

图5　百合多糖和百合多糖硫酸酯的红外图谱Fig.5 FT-IR spectrum of LPs and LPsS

2.4兰州百合多糖硫酸酯的GC-MS分析

LPs和LPsS的水解衍生物GC-MS分析见图6。

图6　单糖混标（A），百合多糖（B）和百合多糖硫酸酯（C）的GC-MS分析的总离子流色谱图Fig.6 Total ion chromatogram of monosaccharide mixed standard（A），LPs（B）and LPsS（C）analysis by GC-MS

由图6可知，未修饰的百合多糖其单糖组成及摩尔比为甘露糖∶葡萄糖∶半乳糖=17∶15∶1；硫酸化修饰后百合多糖硫酸酯的单糖组成未发生改变，而其摩尔比变为甘露糖∶葡萄糖∶半乳糖=18∶14∶1，其修饰后的百合多糖摩尔比发生改变，主要是由于甘露糖与葡萄糖之间相互转化导致的。

2.5LPs和LPsS清除DPPH自由基能力

由图7可知，在0.02～2.00 mg/mL质量浓度范围内，LPs和LPsS对DPPH自由基的清除能力随质量浓度的增加而呈现增长趋势。在该有效质量浓度范围内，LPs糖链结构中引入了硫酸基，分子链的极性增强，黏度下降，溶解性增加，提高了糖链分子结合DPPH自由基的能力［12］，使LPsS对DPPH自由基的清除能力远高于LPs，但低于阳性对照BHT。

图7　LPs和LPsS清除DPPH自由基的能力Fig.7 Scavenging capacity of LPs and LPsS on DPPH free radical

3　结论

采用氯磺酸-吡啶方法，在单因素试验基础上进行响应面法优化，确定了兰州百合多糖硫酸酯制备最优工艺条件：反应温度43℃、反应时间1.5 h、酯化剂（氯磺酸：吡啶）体积比1∶1，该条件下可制备出硫含量可达10.98%的兰州百合多糖酸酯。该制备方法条件温和、简便可行、修饰效果好、硫酸化多糖回收方便，适用于百合多糖的硫酸化修饰。

研究了兰州百合多糖硫酸酯（LPsS）的单糖组成，与兰州百合多糖（LPs）相比，其单糖组分未发生变化，但单糖摩尔比有所变化，甘露糖比例增加而葡萄糖比例降低。

LPs对DPPH自由基具有一定的清除能力，但经过硫酸化修饰所得的LPsS，对DPPH自由基的清除能力大幅提升。因此LPsS具有较好的抗氧化活性，具有一定的食品药品行业功能性开发利用的价值。

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HUANG Yulong1，2，3，ZHAO Baotang2，3，SONG Shen2，3，LI Weiqi1，PANG Zhongcun1，ZHANG Ji2，3*
（1.Agricultural Product Storage and Processing Institute，Gansu Academy of Agricultural Sciences，Lanzhou 730070，China；2.College of Life Science，Northwest Normal University，Lanzhou 730070，China；3.Bioactive Products Engineering Research Center for Gansu Distinctive Plants，Lanzhou 730070，China）

Lily polysaccharide（LPs）was extracted from Lanzhou lily and lily polysaccharide sulfated（LPsS）was prepared by by chlorosulfonic acid-pyridine.Using the sulfur content in LPsS as evaluation indexes，based on response surface methodology（RSM），the combination of three factors：reaction temperature，time and esterification reagent ratio（chlorosulfonic acid：pyridine）were optimized.The optimum conditions were obtained as followed：reaction time 1.5 h，temperature 43℃and esterification reagent（chlorosulfonic acid：pyridine）ratio 1∶1（V/V）.Under the condition，the sulfur content in LPsS was up to 10.98%.The fourier transform-infrared spectrum（FT-IR）scanning showed that that new absorption peak appeared at 1 236 cm-1and 813 cm-1，which indicated that the sulfation was successful.Its monosaccharide composition was analysed by GC-MS，which showed that LPsS was composed of mannose，glucose and galactose，and the molar ratio was 18∶14∶1.Thein vitroantioxidant activity tests showed that LPsS had good scavenging capacity on DPPH·，and its antioxidant activity had improved than the unesterified ones before.

Lanzhou lily；polysaccharides；sulfation；antioxidant activity

O658

0254-5071（2016）06-0122-06

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.06.026

2016-03-10

国家科技支撑计划项目（2012BAD36B04）；甘肃省技术创新项目“兰州百合产业能力提升关键技术的集成与示范”

黄玉龙（1980-），男，助理研究员，硕士，研究方向为农产品贮藏加工。

张继（1963-），女，研究员，博士，研究方向为天然产物化学。