益生菌乳酸发酵提高低聚果糖含量生产的新方法

许宏贤，张晓萍，段钢

（杰能科（中国）生物工程有限公司杜邦工业生物应用科技部，江苏无锡214028）

益生菌乳酸发酵提高低聚果糖含量生产的新方法

许宏贤，张晓萍，段钢*

（杰能科（中国）生物工程有限公司杜邦工业生物应用科技部，江苏无锡214028）

研究报告了一种新的提高低聚果糖（FOS）含量的生产方法。以市售低聚果糖为原料，通过添加甜菜碱进行益生菌乳酸发酵，将原料中可发酵性糖葡萄糖、果糖转化为乳酸，蔗糖部分转化为乳酸，使原料中低聚果糖的含量由51%提高到84%，而发酵液无需进行菌体分离即可用于食品加工，为低聚果糖的生产提供了一种低成本、高效率的纯化方法。

低聚果糖；乳酸；益生菌；甜菜碱

低聚果糖（fructooligosaccharides，FOS）又称寡果糖或蔗果三糖族低聚糖，是指2～5个果糖基为链节，以一个葡萄糖基为链的端基，以果糖基→果糖连接键为主体骨架连结形成的碳水化合物，即是指1～4个果糖基以β-1，2键连接在蔗糖的D-果糖基上而形成的蔗果三糖（GF2）、蔗果四糖（GF3）、蔗果五糖（GF4）和蔗果六糖（GF5）的混合物。作为商品的低聚果糖主要有两种来源［1］：一是中国乃至于亚洲地区普遍生产的以蔗糖为原料的低聚果糖；二是主要产于欧洲的以菊苣为原料的低聚果糖。相对而言从菊苣生产的低聚果糖的聚合度（degree of polymerization，DP）（DP＜9）比用蔗糖生产的聚合度（DP＜4）高。聚合度的高低对FOS在肠内的发酵有着要影响［2-3］。

以蔗糖为底物制备低聚果糖时［4］，由于受到产物葡萄糖和未反应蔗糖的抑制作用，其最大得率只能达到55%～60%，进一步提高目标产物的浓度需采用其他方法，如采用固定化黑曲霉细胞和葡萄糖异构酶［5］；或采用一种由葡萄糖氧化酶和过氧化物酶组成的双酶系的酶处理方法［6］；或者采用模拟移动床的离子交换法等。蔡健等［7］发明了一种高纯度低聚果糖的生产方法，以55%的普通级低聚果糖为原料，利用生物转化原理，采用酵母消化葡萄糖，使低聚果糖的含量达到75%以上；再利用离子交换色谱和膜分离技术相结合，去除其他成份，使产品中的低聚果糖含量达到95%以上；但是该方法中残余酒精可能会影响产品的风味。

乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）是一群形态代谢性能和生理学特征不完全相同的能发酵碳水化合物产生乳酸的革兰氏阳性细菌总称，它的自然宿主是人类、动物和植物［8］。益生菌是指通过摄入适量从而对宿主产生有益作用的活性微生物［9-10］。最常见的益生菌主要有双歧杆菌属（Bifidobacterium）和乳杆菌属（Lactobacillus）［11］。

低聚果糖具有特殊的生物活性功能，其甜度低、热值低、抗龋齿，促进人体肠道内双歧杆菌大量繁殖，明显抑制肠道内有害菌的繁殖及腐败物质的生成，具有防止便秘、增强机体免疫力、降低血脂、促进矿物质吸收等功效，具有间接抗癌、间接生成各种营养物质的作用，不升高血糖［12-17］。利用发酵法去除可发酵性糖从而提高功能性低聚糖含量的研究近年开始见诸报道［18-20］，但是利用市售含50%低聚果糖的糖浆，通过乳酸菌发酵从而提升FOS含量的研究尚未见报道，FOS浓缩糖浆的高渗透压可能是影响乳酸发酵的技术障碍之一。本研究以市售含50%低聚果糖的糖浆为底物，通过添加甜菜碱进行益生菌乳酸发酵，将葡萄糖和果糖转化为乳酸，从而提高FOS含量，该技术无需进行发酵液菌体分离，有着广泛的应用前景和巨大的商业潜力。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

50%FOS糖浆（QHTFOS-G50L，批号：101016067）：量子高科（中国）生物股份有限公司；甜菜碱（BP20）：杰能科（中国）生物工程有限公司；鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）CGMCC 1.2446：中国普通微生物菌种保藏管理中心。

乳酸、葡萄糖、果糖、蔗糖、蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖：美国Sigma-Aldrich公司；醋酸钠：美国Fisher公司；氨水、氢氧化钙、NaOH（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司。

基础液体培养基：蛋白胨10 g/L，牛肉膏10 g/L，酵母膏5 g/L，K2HPO42 g/L，柠檬酸氢二铵2 g/L，无水乙酸钠5 g/L，葡萄糖20 g/L，Tween-80 1 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，MnSO4·H2O 0.05 g/L，CaCO320 g/L，蒸馏水配制，pH 6.5，121℃灭菌20 min。

基础固体培养基：基础液体培养基中加入2%琼脂粉，121℃灭菌20 min。

发酵培养基：玉米浆40g/L，酪蛋白10g/L，牛肉膏10g/L，酵母膏10 g/L，Tween 80 1.5 g/L，MnSO4·H2O 0.3 g/L，CaCO320 g/L，用FOS原浆加水稀释至30°Bx配制，pH 6.5，21℃灭菌20 min。根据试验条件不同添加甜菜碱。

1.2仪器与设备

NBS 2L发酵罐、NBS Innova R43摇床：美国Eppendorf NBS公司；0.5～5000μL移液枪：热电（上海）仪器有限公司；405-60-T酸度计：瑞士梅特勒-多利托仪器有限公司；LDZM-80KCS灭菌柜：上海申安医疗器械有限公司；AC2-6S1超净工作台：日立（中国）有限公司；KBF115培养箱：德国Binder公司；Agilent1100高压液相色谱：美国Agilent公司；ICS-5000型离子色谱：美国Dionex公司。

1.3实验方法

1.3.1乳酸菌活化与扩培

从斜面上取一环乳酸菌，转移到装有100 mL液体基础培养基的500 mL三角瓶中，37℃摇床200 r/min培养12～18 h。

1.3.2乳酸发酵实验

配制发酵培养基，装液量每个发酵罐1 000 mL。打开Bio-Command Plus软件，控制温度45℃；根据试验条件不同用氨水或氢氧化钙调节pH 6.5。按接种量10%接入培养好的液体种子，开始发酵，过程中控制pH温度稳定。发酵过程中取样分析乳酸含量，发酵结束取样分析FOS含量。

1.3.3发酵液成分含量分析

依据参考文献［24］采用高效液相色谱（highperformance liquid chromatography，HPLC）法分析检测发酵液中乳酸含量。

1.3.4低聚果糖含量分析

采用离子色谱（ion chromatography，IC）法分析低聚果糖含量。离子色谱条件：CarboPakTM PA200色谱柱（250mm×4mm），CarboPakTMPA10保护柱（50mm×4mm）；柱温30℃；流速1 mL/min，进样量25 μL。梯度洗脱条件：0～5 min，100 mmol/L氢氧化钠，0～120 mmol/L醋酸钠；5～50 min，100 mmol/L氢氧化钠，0～120 mmol/L醋酸钠；10～50 min，100 mmol/L氢氧化钠，120～320 mmol/L醋酸钠；50～55 min，100 mmol/L氢氧化钠，320 mmol/L醋酸钠；55～65 min，100 mmol/L氢氧化钠。

2　结果与分析

2.1原料糖浆低聚果糖含量分析

考虑到原料低聚果糖的浓度达到75°Bx，属于极高渗透压环境，故而加水稀释至30°Bx，采用离子色谱（IC）法分析低聚果糖的组成。结果如表1所示。

表1　原料糖浆中各种糖含量检测结果Table 1 Detection results of all kinds of sugars content in raw material syrup

由表1可知，市售的低聚果糖糖浆中低聚果糖（蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖）含量在51%左右，仍然含有接近50%的可发酵性糖（葡萄糖、果糖、蔗糖），这些可发酵性糖的存在会限制低聚果糖的使用范围，如糖尿病人、肥胖病人、减肥人士的服用等，提高低聚果糖的含量以便扩大其应用范围。

2.2不同添加量甜菜碱对发酵的影响

相关研究表明［19］，在高渗环境下细胞的生长速率和酶活会大幅下降，甜菜碱作为一种外源性的渗透保护剂，可以平衡细胞内外的渗透压，从而提高微生物对高渗环境的耐受性；对于乳酸菌（Lactobacillus）［20］，甜菜碱通过提高L-鼠乳酸脱氢酶的活性和细胞生长对渗透压的耐受性从而提高乳酸产量。本试验将不同含量的甜菜碱加入到鼠李糖乳杆菌（L.rhamnosus）发酵培养基中培养，20%氨水调节pH，定期取样，采用HPLC测定发酵液中乳酸产量，结果如图1所示。发酵结束采用IC法分析FOS组成。结果如表2所示。

图1　不同甜菜碱添加量对乳酸产量的影响Fig.1 Effects of different betaine addition on lactic acid yield

表2　发酵结束后糖浆中各种糖含量Table 2 Contents of all kinds of sugars in syrup after the fermentation

由图1可知，尽管在发酵的前6 h看不出乳酸含量上的差别，但从22 h起，添加甜菜碱乳酸产量明显高于不添加甜菜碱的乳酸产量；并且不管是否添加甜菜碱，乳酸产量在发酵46～54 h几乎没有变化，说明乳酸发酵基本结束。综合图1表2可知，添加甜菜碱发酵起始的95.1 g/L葡萄糖和15.9 g/L果糖全部被转化成乳酸，33 g/L蔗糖中有6.1 g/L被转化成乳酸，残余26.9 g/L；发酵前后蔗果三糖分别是79.3 g/L和79.0 g/L、蔗果四糖65.8 g/L和59.3 g/L、蔗果五糖9.6 g/L和8.0 g/L；仅略有降低；而不添加甜菜碱的一组尽管相关数据未能显示，但残余葡萄糖仍有24 g/L，说明残余的可发酵性糖依然很高。总体来讲，通过添加3 g/L甜菜碱进行益生菌乳酸发酵，发酵前总糖为298.7 g/L，发酵后为167.1 g/L，有131.6 g/L的糖通过鼠李糖乳杆菌（L.rhamnosus）转化为130 g/L的乳酸；发酵液的糖成分为84%低聚果糖、16%蔗糖，另外还含有乳酸、鼠李糖乳杆菌（L.rhamnosus）等可食用成分。

3　结论

本研究利用益生乳酸菌进行市售低聚果糖乳酸发酵，将原料中可发酵性糖葡萄糖、果糖转化为乳酸，蔗糖部分转化为乳酸，使原料中低聚果糖的含量由51%提高至84%，发酵液无需进行菌体分离即可用于食品加工，从而进一步扩大了低聚果糖在各类功能食品、健康食品中的应用。当然有关成品的剂型、应用仍需要感兴趣的企业进行拓展，相信随着人们健康意识的不断提高，新型的富含益生菌和乳酸的低聚果糖的应用必将走入我们的日常生活。

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XU Hongxian，ZHANG Xiaoping，DUAN Gang*
（Genencor（China）Bioproduct Co.，Ltd.，DuPont Industrial Biosciences，Wuxi 214028，China）

A new production method of improving fructooligosaccharides（FOS）content was reported.Using the FOS sold on the market as the raw material，the probiotic lactic acid fermentation was conducted with addition of the betaine.The fermentable sugars（such as glucose and fructose）in the raw material were translated into lactic acid，the sucrose was translated into lactic acid partly，and the FOS content in the raw material was increased from 51%to 84%.The fermentation liquor without bacterium separation could be used to food processing，which provided a purification method with low cost and high efficiency for fructooligosaccharides production.

fructooligosaccharides；lactic acid；probiotics；betaine

Q815

0254-5071（2016）06-0143-03

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.06.030

2016-03-29

许宏贤（1970-），女，高级工程师，硕士，研究方向为食品与发酵。

段钢（1966-），男，博士，研究方向为工业酶的应用。