酶法辅助聚二乙醇-200提取金银花叶中绿原酸的工艺优化

石长萍，向福，2*，杨报，方元平，2

（1.黄冈师范学院生命科学学院，湖北黄冈438000；2.大别山特色资源开发湖北省协同创新中心，湖北黄冈438000）

酶法辅助聚二乙醇-200提取金银花叶中绿原酸的工艺优化

石长萍1，向福1，2*，杨报1，方元平1，2

（1.黄冈师范学院生命科学学院，湖北黄冈438000；2.大别山特色资源开发湖北省协同创新中心，湖北黄冈438000）

为了优化酶法辅助聚二乙醇（PEG）-200提取金银花叶中绿原酸的工艺，利用单因素试验确定PEG-200体积分数、料液比、酶解时间等关键影响因素，以绿原酸提取率为响应值进行响应面优化分析。结果表明，金银花叶中绿原酸用纤维素酶辅助PEG-200提取的最佳条件为纤维素酶添加量为2%，料液比1∶27（g∶mL），PEG-200体积分数50%，pH 4，55℃酶解2.0 h，提取温度90℃，提取时间15 min，在该条件下，绿原酸提取率为6.59%。该工艺环境友好、条件温和、提取效率高，可用于工业化提取金银花叶中绿原酸。

金银花叶；响应面；绿原酸；聚乙二醇；酶法辅助提取

绿原酸具有清除自由基、保护神经、预防心血管疾病、抑制α-葡萄糖苷酶、抗炎症等多种生物活性［1-2］，具有广泛的医疗保健用途。大别山地区盛产金银花，其叶中含有丰富的绿原酸［3］，但金银花叶长期被视为非药用部位而未能得到有效利用［4］。当前金银花原料价格高涨，利用来源更丰富、采集更方便、价格更低廉的金银花叶提取绿原酸，对大别山金银花特色资源的深加工和综合利用具有广阔的应用前景。

聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）成本低、不挥发、可生物降解、性质稳定、安全无毒，是一种环境友好的绿色溶剂［5］。笔者实验室研究了微波法辅助PEG-200提取金银花叶中绿原酸的工艺［6］，虽然提取效果好，但微波强度难以控制，且能耗大，微波反应器价格高［7］。生物酶法具有效率高、特异性好、条件温和、易于控制等特点，能辅助强化活性成分的提取［8-9］。如纤维素酶通过降解细胞壁的纤维素，能温和有效地破坏植物细胞壁骨架结构，让植物活性物质成分释放溶出［10-11］，从而强化提取效果。然而，目前尚无酶法辅助PEG-200提取金银花叶中绿原酸的相关报道。

本研究以金银花叶为实验材料，对其绿原酸采用纤维素酶辅助PEG-200溶剂进行提取。以绿原酸的提取率为响应值，通过单因素试验选择PEG-200体积分数、料液比、酶解时间等3个关键因素为自变量，绿原酸提取率为响应分析指标，采用Box-Behnken中心组合试验方法设计响应面优化方案，探讨金银花叶中绿原酸的酶法辅助PEG-200提取工艺的优化条件，从而为大别山特色金银花资源的深加工和综合利用提供技术参考。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

金银花叶：采于湖北楚天舒药业有限公司金银花基地，阴干，粉碎备用；绿原酸标准品（纯度≥98%）（批号20150705）：上海金橞生物科技有限公司；PEG-200（分析纯）：上海山浦化工有限公司；酸性纤维素酶（20 000 U/g）（CAS 9012-54-8）：湖北帝鑫化工制造有限公司。

1.2仪器与设备

VarianCary100Scan型紫外可见分光光度计：美国Varian公司；Ax-205 METTLER TOLEDO型电子天平：瑞士梅特勒-托利多集团；DZKW-D-2型电热恒温水浴锅：北京西城区医疗器械厂；UB-7pH计：赛多利斯科学仪器（北京）有限公司。

1.3实验方法

1.3.1绿原酸标准曲线及提取率测定

按照文献［6］的方法，在波长327 nm条件下测定吸光度值，以绿原酸质量浓度（C）为横坐标，吸光度值（A）为纵坐标，得标准曲线回归方程为：A=0.05C-0.038 7，相关系数R2=0.999 7，绿原酸质量浓度在10.8～54.0 μg/mL范围内与吸光度值呈良好的线性关系。样品中绿原酸的含量按照标准曲线回归方程进行计算。绿原酸提取率计算公式如下：

式中：Y为绿原酸提取率，%；C为样品中绿原酸的含量，μg/mL；N为稀释倍数；m为金银花叶的质量，g；V为绿原酸提取液体积，mL。

1.3.2单因素试验

称取5份金银花叶粉末5 g置于圆底烧瓶，以不同的料液比加入一定体积分数的PEG-200溶液，在一定的pH值和纤维素酶添加量条件下，用一定温度的恒温水浴酶解不同时间，然后在不同温度下对绿原酸进行回流提取不同的时间，从而分别考察料液比、PEG-200体积分数、pH、纤维素酶量、酶解时间、酶解温度、提取时间和提取温度等因素对金银花叶中绿原酸提取率的影响。

1.3.3响应面优化试验

根据响应面方法的Box-Behnken中心组合试验设计原理，选取单因素试验中对绿原酸提取率影响比较显著的PEG-200体积分数（X1）、料液比（X2）和酶解时间（X3）为自变量，以绿原酸提取率（Y）为响应值，设计3因素3水平的响应面优化试验，如表1所示。

表1　绿原酸提取响应面分析因素及水平Table 1 Factors and levels of response surface analysis for chlorogenic acid extraction

2　结果与分析

2.1单因素试验结果

2.1.1纤维素酶添加量对绿原酸提取率的影响

称取5份5 g金银花叶粉末，按1∶20（g∶mL）料液比加入体积分数30%的PEG-200，pH 6，分别添加金银花叶质量1%、2%、3%、4%、5%的纤维素酶，在55℃恒温酶解2 h后，在80℃条件下回流提取15 min，考察加酶量对绿原酸提取率的影响，结果如图1所示。

图1　纤维素酶添加量对绿原酸提取率的影响Fig.1 Effect of cellulase addition on the extraction rate of chlorogenic acid

由图1可知，当纤维素酶添加量为2%时，绿原酸提取率最高，为6.52%；继续增加纤维素酶添加量，绿原酸提取率则降低。这是因为纤维素酶量增加到一定程度时，酶分子过于饱和，一部分酶不能与底物结合，使得水解速度变慢，导致绿原酸提取率下降［12］。因此，纤维素酶添加量宜选择2%。

2.1.2酶解温度对绿原酸提取率的影响

称取5份5 g金银花叶粉末，按1∶20（g∶mL）料液比加入体积分数30%的PEG-200，pH 6，添加金银花叶质量2%的纤维素酶，分别在40℃、45℃、50℃、55℃、60℃恒温条件下酶解2 h后，在80℃条件下回流提取15 min，考察酶解温度对绿原酸提取率的影响，结果如图2所示。

图2　酶解温度对绿原酸提取率的影响Fig.2 Effect of hydrolysis temperature on the extraction rate of chlorogenic acid

纤维素酶在50～70℃范围内比较稳定［13］。由图2可知，在55℃恒温条件下，绿原酸提取率达到峰值，为6.11%，随着酶解温度增大，提取率则下降。因此，酶解温度以55℃为宜。

2.1.3酶解时间对绿原酸提取率的影响

称取5份5 g金银花叶粉末，按1∶20（g∶mL）料液比加入体积分数30%的PEG-200，pH 6，添加金银花叶质量2%的纤维素酶，在55℃恒温条件下分别酶解1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h、3.0 h后，在80℃条件下回流提取15 min，考察酶解时间对绿原酸提取率的影响，结果如图3所示。

图3　酶解时间对绿原酸提取率的影响Fig.3 Effect of hydrolysis time on the extraction rate of chlorogenic acid

由图3可知，当酶解时间从1.5～2.0 h，绿原酸提取率迅速增加到峰值，随着酶解时间增加，绿原酸提取率下降趋势明显。绿原酸不稳定，长时间酶解很容易导致绿原酸发生异变和分解，使得提取率降低。因此，酶解时间对绿原酸提取影响明显，不考虑其他因素则以2.0 h为宜。

2.1.4pH对绿原酸提取率的影响

称取5份5 g金银花叶粉末，按1∶20（g∶mL）料液比加入体积分数30%的PEG-200，pH分别为2、3、4、5、6，添加金银花叶质量2%的纤维素酶，在55℃恒温酶解2.0 h后，在80℃条件下回流提取15 min，考察pH对绿原酸提取率的影响，结果如图4所示。

图4　pH对绿原酸提取率的影响Fig.4 Effect of pH on the extraction rate of chlorogenic acid

纤维素酶最适pH值在4.0～6.0范围［13］。由图4可知，pH值为4时，绿原酸提取率最高，为6.44%；但pH值升高提取率又降低。pH值对酸性纤维素酶酶活力影响显著，pH值越高，纤维素酶与金银花叶细胞之间静电斥力越大，吸附越不牢固，降解效率降低［14-15］。因此，pH值宜选择4。该结论与向福等［16］的研究结果一致。

2.1.5PEG-200体积分数对绿原酸提取率的影响

称取5份5 g金银花叶粉末，按1∶20（g∶mL）料液比，分别加入体积分数10%、20%、30%、40%、50%的PEG-200，pH 6，添加金银花叶质量2%的纤维素酶，在55℃恒温酶解2 h后，在80℃条件下回流提取15 min，考察PEG-200体积分数对绿原酸提取率的影响，结果如图5所示。

图5　PEG-200体积分数对绿原酸提取率的影响Fig.5 Effect of PEG-200 concentration on the extraction rate of chlorogenic acid

由图5可知，PEG-200体积分数在10%～40%时，绿原酸提取率随着PEG-200体积分数的增加而不断增大，在体积分数40%时增加到最高，为4.18%，提取效果最好；之后，绿原酸提取率随PEG-200体积分数的增加则开始降低。PEG通过改变溶液的耗散因素而加快了能量传递速度和提取效率［5］，故在一定范围内，随着PEG-200体积分数增大，绿原酸提取率明显增加；同时，体积分数越大，PEG-200溶液的黏度就越高，从而影响提取过程的传质，表现为绿原酸提取率下降趋势明显。因此，PEG-200体积分数对绿原酸提取影响明显，以40%为宜。

2.1.6料液比对绿原酸提取率的影响

称取5份5g金银花叶粉末，分别按1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30（g∶mL）料液比加入体积分数30%的PEG-200，pH 6，添加金银花叶质量2%的纤维素酶，在55℃恒温酶解2 h后，在80℃条件下回流提取15 min，考察料液比对绿原酸提取率的影响，结果如图6所示。

图6　料液比对绿原酸提取率的影响Fig.6 Effect of solid-liquid ratio on the extraction rate of chlorogenic acid

由图6可知，料液比对绿原酸提取率影响明显，当液料比为1∶25（g∶mL）时绿原酸提取率最高，为5.55%，继续增大料液比，提取率略有下降趋势。因此，料液比以1∶25（g∶mL）为宜。

2.1.7提取温度对绿原酸提取的影响

称取5份5 g金银花叶粉末，按1∶20（g∶mL）料液比加入体积分数30%的PEG-200，pH 6，添加金银花叶质量2%的纤维素酶，在55℃恒温酶解2 h后，分别在75℃、80℃、85℃、90℃、95℃条件下回流提取15 min，考察提取温度对绿原酸提取率的影响，结果如图7所示。

图7　提取温度对绿原酸提取率的影响Fig.7 Effect of extraction temperature on the extraction rate of chlorogenic acid

由图7可知，绿原酸提取率随着提取温度的增加而呈明显的上升趋势，在90℃时提取率达到峰值，为4.53%；继续升高提取温度，提取率呈明显的下降趋势。虽然提高回流提取的温度有利于增强绿原酸的提取效果，增加提取率，但绿原酸在过高温度时易分解。因此，提取温度以90℃为宜。

2.1.8提取时间对绿原酸提取率的影响

称取5份5 g金银花叶粉末，按1∶20（g∶mL）料液比加入体积分数30%的PEG-200，pH 6，添加金银花叶质量2%的纤维素酶，在55℃恒温酶解2 h后，在80℃条件下分别回流提取5 min、15 min、25 min、35 min、45 min，考察提取时间对绿原酸提取率的影响，结果如图8所示。

图8　提取时间对绿原酸提取率的影响Fig.8 Effect of extraction time on the extraction rate of chlorogenic acid

由图8可知，提取时间太短，提取率较低，增加提取时间则提取率显著增加，提取15 min后，绿原酸提取率达到最大，为4.34%；但继续增加提取时间，提取率呈明显的下降趋势。这是由于在高温提取条件下（80℃温度），绿原酸会因为回流提取时间过长而易分解。因此，提取时间选择15 min。

2.2响应面试验结果

根据单因素试验结果，固定加酶量、酶解温度、pH、提取温度、提取时间分别为2%、55℃、4、90℃和15 min，以绿原酸提取率（Y）为响应值，以PEG-200体积分数（X1）、料液比（X2）、酶解时间（X3）为自变量，用Box-Behnken中心组合试验设计响应面优化方案，试验设计及结果见表2，回归模型方差分析见表3。

利用Design Expert 8.0.6软件对表2试验结果进行多元回归拟合，得到绿原酸提取率（Y）对PEG-200体积分数（X1）、料液比（X2）和酶解时间（X3）的二次多项回归模型编码方程：

表2　响应面试验设计及结果Table 2 Design and results of response surface experiments

根据表3所示响应面方差分析结果，二次多项回归拟合模型极其显著（P＜0.000 1），而失拟项不显著（P=0.210 2＞0.05），说明回归模型对试验数据拟合度较好；模型信噪比为23.497＞4，说明拟合模型有意义，可信度高；变异系数为0.96%，表明操作稳定性好；预测拟合度0.877 0和校正拟合度0.974 0基本一致，说明该模型相关性好，可用于预测。另外，F值反映了自变量因子对响应值的重要性，F值越大，P值越小，该因子对响应值影响越显著。根据表3中F（X1）=313.24＞F（X2）=55.27＞F（X3）可知，各自变量因子的主效应关系为：PEG-200体积分数＞料液比＞酶解时间。同时，X2、X3、X1X3、X2X3、X22和X32对响应值Y的作用显著（P＜0.05），而X1和X12对响应值Y的作用则极显著（P＜0.000 1）。因此，尽管PEG-200体积分数、料液比和酶解时间的交互作用对绿原酸的提取率影响较小，但各因素与响应值Y之间并不是简单的线性关系，各因子二次项也影响绿原酸提取率的变化。决定系数R2=0.988 6表明此模型能解释98.86%的响应值变化，也就是说能影响绿原酸提取率的作用变量只有约1.14%未计入拟合模型。因此，酶法辅助PEG提取金银花叶中绿原酸的工艺过程可用该二元回归多项式代替真实试验进行预测。

表3　回归模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

二元拟合模型的响应面分析结果如图9所示，表示用于响应面分析的PEG-200体积分数、料液比和酶解时间等3个自变量因子中，当某个因子为零水平时，另外两个因子对绿原酸提取率的协同作用关系，等高线的形状可直观反映两因子的交互作用强弱和显著程度。由图9可知，料液比和酶解时间的等高线图中心区域呈椭圆形，说明二者之间交互作用明显；PEG-200体积分数分别与料液比和酶解时间的等高线图中心区域均不构成椭圆，则没有明显的交互作用。此外，PEG-200体积分数、料液比、酶解时间等三个因素与响应值绿原酸提取率均呈抛物线关系，且响应面均为凸面，开口向下，说明在试验点的连续区域内存在最大值。通过二元拟合模型求解，预测其最佳提取工艺条件为料液比1∶26.59（g∶mL）、PEG-200体积分数52.57%、酶处理时间为2.04 h，在此条件下，绿原酸提取率理论预测值为6.600 1%。

图9　PEG-200体积分数、料液比和酶解时间交互作用对绿原酸提取率影响的响应面及等高线Fig.9 Response surface plots and contour line of effects of interaction between PEG-200 concentration，solid liquid ratio and hydrolysis time on extraction rate of chlorogenic acid

2.3响应面验证试验

验证时，为便于实际操作，将最佳工艺条件预测值修正为料液比1∶27（g∶mL）、PEG-200体积分数50%和酶解时间2.0 h。其他工艺条件为pH 4，纤维素酶量2%，55℃恒温水浴，提取温度90℃，提取时间15 min。在修正后的最佳条件下，进行了3次平行验证试验，绿原酸实测平均提取率为（6.59±0.01）%，与理论预测值6.60%吻合度较高，说明所用二元回归拟合模型对酶法辅助PEG提取金银花叶中绿原酸的实验过程具有一定的指导作用。

相比黄荣等［6］报道的微波辅助PEG提取法，绿原酸提取率增加了12.27%。酶解时间虽长达2.0 h，但55℃的酶解温度比较温和，不会破坏绿原酸；提取温度尽管升高至90℃，但提取时间较微波辅助提取法缩短了37.5%，高温短时，既有利于强化提取效率，又能保护绿原酸。因此酶法辅助比微波辅助提取效率更高，条件更温和，且同样绿色环保，适合工业化生产。

3　结论

本研究在单因素试验的基础上，结合响应面试验优化了酶法辅助PEG-200提取金银花叶中绿原酸的工艺条件，建立了最佳提取工艺条件为料液比1∶27（g∶mL）、PEG-200体积分数50%、纤维素酶添加量2%、pH 4、55℃恒温酶解2.0 h、然后在90℃条件下回流提取15 min。此时，绿原酸提取率达到6.59%。该工艺条件温和、环境友好、提取效率高，可用于工业化提取金银花叶中绿原酸。

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SHI Changping1，XIANG Fu1，2*，YANG Bao1，FANG Yuanping1，2
（1.College of Life Sciences，Huanggang Normal University，Huanggang 438000，China；2.Hubei Collaborative Innovation Center for the Characteristic Resources Exploitation of Dabie Mountains，Huanggang 438000，China）

In order to optimize the enzyme-assisted extraction conditions of chlorogenic acid with PEG-200 fromLonicerae japonicaleaves，the key factors such as PEG-200 concentration，solid-liquid ratio and hydrolysis time were determined by single factor experiments and optimized and analyzed by response surface method using extraction rate of chlorogenic acid as response value.The results showed that the optimum extraction conditions of chlorogenic acid were cellulose addition 2%，solid-liquid ratio 1∶27（g∶ml），PEG-200 concentration 50%，pH 4，hydrolysis temperature 55℃，hydrolysis time 2.0 h，extraction temperature 90℃and extraction time 15 min.Under the conditions，the extraction rate of chlorogenic acid was 6.59%.This method was environment-friendly，mild conditions and high extraction efficiency，which was suitable for industrialized production of chlorogenic acid fromLonicerae japonicaleaves.

Lonicerae japonicaleaves；response surface method；chlorogenic acid；polyethylene glycol；enzyme-assisted extraction

R284.2

0254-5071（2016）06-0155-06

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.06.033

2016-03-20

湖北省自然科学基金重点项目（2014CFA129）；湖北省大学生创新创业训练计划项目（201510514019）

石长萍（1994-），女，本科生，研究方向为天然产物提取。

向福（1977-），男，副教授，博士，研究方向为天然植物资源利用。