三唑磷单克隆抗体制备以及酶联免疫试剂盒的研究

冯才伟，何方洋*，黄健，贾芳芳，李行

（1.北京勤邦生物技术有限公司，北京102206；2.北京市食品安全免疫快速检测工程技术研究中心，北京102206；3.北京市优质农产品产销服务站，北京100101）

三唑磷单克隆抗体制备以及酶联免疫试剂盒的研究

冯才伟1，2，何方洋1，2*，黄健3，贾芳芳1，2，李行1，2

（1.北京勤邦生物技术有限公司，北京102206；2.北京市食品安全免疫快速检测工程技术研究中心，北京102206；3.北京市优质农产品产销服务站，北京100101）

通过三唑磷与乙酰氯反应，得到三唑磷半抗原，通过免疫动物得到抗三唑磷单克隆抗体，将其应用于能够检测蔬菜中三唑磷残留量的酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒，结果表明：该试剂盒对结球甘蓝中三唑磷的检测限为49.6 μg/kg，IC50为6.9 μg/L，加样回收率为70.0%～93.5%，三唑磷标准曲线线性范围为1～81 μg/L，批内、批间的相对标准偏差（RSD）＜10%，三唑磷单克隆抗体与毒死蜱、对硫磷的交叉反应率分别为2.3%，3.8%。4℃条件该试剂盒下能够保存12个月，稳定性较好。

三唑磷；单克隆抗体；ELISA试剂盒

三唑磷是一种中等毒性的广谱有机磷杀虫剂［1］，作为高效替代农药已经大量使用多年。但是由于其半衰期较长、容易残留，环境和食品中其残留超标的问题逐渐引起关注。因此，建立三唑磷残留的快速检测技术，对加强其残留监测，减少环境污染，保障人体健康具有重要意义［2］。欧盟规定三唑磷作为农药品种在蜂王浆、花粉等不得检出（低于0.01 mg/kg），在水果、香菜、小豆蔻、黑胡椒、白胡椒等农产品中限量仅为0.07 mg/kg［3］；我国国家标准GB 2763—2014《食品中农药最大残留限量》中规定了三唑磷的最大残留限量为：蔬菜中结球甘蓝、节瓜均为100 μg/kg［4］。

目前，检测三唑磷的检测方法有高效液相色谱法［5-6］、气相色谱法［7-8］、色谱-质谱联用法和压电免疫传感器等［9-11］。这些仪器方法的优点在于灵敏度高，缺点是费用很高，操作也较为复杂，对企业质量内控以及现场监管均具有一定的局限性。相较于其他方法，酶联免疫吸附法具有灵敏性高、特异性强的优点。基于上述原因，制备了抗三唑磷单克隆抗体，同时开发了检测蔬菜中三唑磷残留量的酶联免疫吸附测度（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒，不仅方便基层检测机构进行初筛检查，而且利于生产厂家进行较为高效、快速的自检。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

三唑磷标准品：北京标准物质研究中心；氢氧化钠、乙酸乙酯、磷酸盐、卵清蛋白、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、四甲基联苯胺、二氯甲烷、三唑磷、乙酰氯、硫酸镁、羧甲基羟胺（以上均为分析纯）：北京百欣试剂公司；蔬菜：市售；复溶工作液、细胞：北京勤邦生物技术有限公司。

1.2仪器与设备

MR3酶标仪：上海雷勃分析仪器有限公司；HFJ-10振荡器、MX-F涡旋仪：湖南湘立科学仪器有限公司。

1.3方法

1.3.1制备抗原

（1）半抗原的制备

将10 mL二氯甲烷和0.5 g三唑磷加入100 mL三口烧瓶，冷藏降温至-5℃，搅拌下加入1.01 mol/L的乙酰氯，控温加入2 mol/L的三氯化铝，控温5℃反应6 h后，加稀盐酸和冰水，乙酸乙酯萃取，水洗，无水硫酸镁干燥有机相，减压蒸干溶剂，石油醚-乙酸乙酯体系重结晶得乙酰化物。

将上步骤获得的乙酰化物加入100 mL三口烧瓶，再加入10 mL吡啶进行溶解，加入1.2 mol/L的羧甲基羟胺，65℃反应5 h，乙酸乙酯萃取，水洗，无水硫酸镁干燥有机相，减压蒸馏，得到半抗原产物，三唑磷半抗原的合成路线见图1。

图1　三唑磷半抗原合成途径Fig.1 Synthesis pathway of triazophos hapten

（2）免疫原的制备

用1 mL二甲基甲酰胺（dimetbylformamide，DMF）溶解12 mg三唑磷半抗原，得到溶液A；用0.2 mL水充分溶解30 mg碳二亚胺（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）后，加入溶液A中，室温下搅拌24 h，即可得到反应液B。称取牛血清白蛋白50 mg，使之充分溶解在3.8 mL磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS）（pH为7.2）中，将反应液B逐滴缓慢滴加到该蛋白溶液中，并于室温下搅拌24 h，然后在4℃条件下，用0.01 mol/L PBS透析3 d，每天换3次透析液，保存于-20℃。

（3）包被原的制备

包被原制备方法即为：将（2）制备免疫原的牛血清白蛋白替换为卵清蛋白，其他步骤相同。

1.3.2制备酶标记抗抗体

将1.3.1得到的免疫原注入Balb/c小鼠体内，产生抗血清。取免疫Balb/c小鼠脾细胞，与SP2/0骨髓瘤细胞融合，通过间接竞争酶联免疫法测定细胞上清液，筛选阳性孔，进行克隆化，获得能够稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。将杂交瘤细胞置于细胞培养基中，用辛酸-饱和硫酸铵法将得到的培养液进行纯化，得到三唑磷单克隆抗体［12］，用该抗体免疫无病原体羊，得到羊抗鼠抗抗体［13］，然后偶联辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）［14］，得到酶标记抗体。

1.3.3优选抗原包被浓度、单克隆抗体浓度，制备酶标板

在测定波长为450 nm，抗原稀释倍数依次为1∶1 000、1∶2 000、1∶4 000；单克隆抗体稀释倍数依次为：1∶20 000、1∶40 000、1∶80 000、1∶160 000；酶标记抗抗体液的稀释倍数为1∶1 000时，分别测定0以及0.05 μg/L质量浓度的三唑磷标准品的吸光度值，并计算百分吸光度值，计算公式如下：

将100 μL抗原包被液包被于酶标板中，37℃孵育2h，然后清洗酶标板，加入150 μL封闭液（封闭液为0.05%牛血清白蛋白（BSA））溶解于0.02 mol/L PBS中，37℃孵育2 h［15］，即制备完成酶标板。

1.3.4蔬菜样本的前处理方法

称取2.0 g均质蔬菜样本至10 mL聚苯乙烯离心管中，分别加入2 mL 0.1mol/L NaOH溶液和10 mL乙酸乙酯，振荡5 min，混匀；室温离心5 min，转速≥3 000 r/min；移取1 mL上层有机相至玻璃试管中；于50～60℃水浴流下氮气吹干；加入1 mL复溶工作液，涡动1 min。取200 mL加入1 800 mL复溶工作液中，混匀；取50 mL用于分析。

1.3.5酶标板检测

向1.3制备完成的酶标板中依次加入质量浓度为0、1 μg/L、3 μg/L、9 μg/L、27 μg/L、81 μg/L的标准品溶液，以及1.3.6前处理完成的蔬菜样本溶液，每孔均为50 mL，再加入抗体液每孔50 mL，室温避光反应30 min。清洗酶标板，然后每孔加入制备的酶标记抗抗体100 μL，室温避光反应30 min。清洗酶标板，然后每孔加入50 μL H2O2，再加入每孔50 μL四甲基联苯胺，室温避光反应15 min。最后每孔加入2 mol/L H2SO450 μL，测定酶标板孔的OD450nm值。

1.3.6计算蔬菜样本中三唑磷含量

标准曲线的横坐标为三唑磷标准品质量浓度（μg/L）的对数值，纵坐标为标准品百分吸光度值，然后将蔬菜样本的OD450nm代入标准曲线，得到相应的质量浓度，该质量浓度乘以稀释倍数即为蔬菜样本中三唑磷残留量。

1.3.7检测性能

（1）计算检出限

分别检测20份蔬菜空白样本，利用空白样本浓度的平均值加上3倍标准差，计算检出限（limit of detection，LOD），即检测方法可检测出的最低被测物浓度［16］。

（2）精密度和准确度

我国国家标准GB 2763—2014《食品中农药最大残留限量》中规定了结球甘蓝、节瓜中三唑磷的最大残留限量均为100 μg/kg。《农残办技术材料要求及审查程序》规定：当ELISA试剂盒检测有最高残留限量（maximum residue limit，MRL）的药物时，测定回收率的添加质量浓度为0.5× MRL、1×MRL和2×MRL（或1.5×MRL）。因此，本实验按照上述要求，分别对结球甘蓝样本添加三唑磷，使其质量浓度达到50 μg/kg、100 μg/kg和200 μg/kg，测定加标回收率，以此评价该试剂盒的准确度。同时，每个样本做4个平行，按照上述1.3.3制备3批酶标板，计算相对标准偏差（relativestandard deviation，RSD），以此评价该试剂盒的精密度。

（3）测定稳定性

通过测定试剂盒的保存条件，评价该试剂盒的稳定性。将试剂盒保存于4℃，每个月计算一次0.05 μg/L的标准品在波长450 nm条件下的百分吸光度值（即最大百分吸光度值）、半抑制浓度（half maximal inhibitory concentration，IC50）以及结球甘蓝样本的回收率，连续测定12个月，记录最大百分吸光度值。

（4）测定抗体特异性

毒死蜱、对硫磷与三唑磷的结构类似［17］，测定这三种药物的IC50，根据下式计算该试剂盒对于毒死蜱、对硫磷的交叉反应率：

2　结果与分析

2.1鉴定半抗原

利用核磁共振氢谱法测定1.2.1制备的半抗原，如图2所示，11.0 ppm的羧基信号峰、2.85 ppm甲基信号峰的出现，说明半抗原合成成功［18-19］。

图2　三唑磷半抗原核磁共振氢谱Fig.2 H1NMR of triazophos hapten

2.2优选抗原包被浓度、单克隆抗体浓度

测定不同单克隆抗体稀释倍数以及抗原稀释倍数条件下，质量浓度为0和0.05 μg/L的三唑磷标准品的OD450nm值，结果见表1。

表1　抗原、抗体的浓度优选结果Table 1 Concentration detection results of antigen and antibody

通过我公司多年实验验证，当OD450nm（0.05 μg/L）/ OD450nm（0）的抑制率在70%～85%时，以抗原、单克隆抗体的最大稀释倍数作为抗原、单克隆抗体的最佳稀释倍数［20］，由表1可见，本研究优选抗原稀释倍数为2 000，最佳单克隆抗体稀释倍数为80 000。

2.3标准曲线

以三唑磷标准品质量浓度对数值为横坐标，以OD450nm（0.05 μg/L）/OD450nm（0）的对数值为纵坐标绘制标准曲线，结果见图3。

图3　三唑磷标准曲线Fig.3 Standard curve of triazophos

由图3可知，标准曲线线性方程为y=-1.682x+1.516，R2为0.996 2。标准曲线的线性范围为1～81 μg/L，IC50（半抑制浓度）为6.9 μg/L。

2.4计算检测限

20个结球甘蓝空白样本中三唑磷的检测结果见表2。检测限以测定平均值加3倍标准差计算。

表2　结球甘蓝空白样本检测限测定结果Table 2 Detection limit results of cabbage blank sample μg/kg

由表2可知，20个结球甘蓝样本中三唑磷的测定结果平均值为18.5 μg/kg，标准差为10.4%，最低检测限为49.6 μg/kg。

2.5精密度和准确度

测定添加不同质量浓度三唑磷的结球甘蓝样本的精密度及准确度试验结果见表3。

由表3可知，回收率范围是70.0%～93.5%，可见当添加质量浓度为50 μg/kg、100 μg/kg和200 μg/kg时，批内相对标准偏差范围是6.9%～9.7%；批间相对标准偏差范围是7.6%～9.6%。可见，批内、批间相对标准偏差分别为6.9%～9.7%、7.6%～9.6%，均＜10%，说明试剂盒精密度和准确度良好。

表3　精密度及准确度试验结果Table 3 Results of precision and accuracy tests

2.6稳定性

将试剂盒保存在4℃条件下，每月测定最大百分吸光度值、IC50以及回收率，稳定性结果见表4。由表4可知，测定的无添加三唑磷试剂盒的最大百分吸光度值范围是1.70～1.91，半数抑制浓度范围是5.1～7.9 μg/L，三唑磷添加回收率范围是70.9%～92.5%，由此可见，各指标均在正常范围之内。该试剂盒在4℃至少能够保存12个月。

表4　试剂盒在4℃保存的稳定性Table 4 Stability of the kit kept at 4℃

2.7抗体特异性的测定

三唑磷抗体与毒死蜱、对硫磷的交叉反应率见表5。

由表5可知，三唑磷抗体与毒死蜱、对硫磷的交叉反应率分别为2.3%、3.8%，交叉反应率低，由此可见，三唑磷抗体特异性良好。

表5　交叉反应率试验结果Table 5 Experimental results of cross reaction rate test

2.8讨论

梁赤周等［17］利用酶联免疫吸附测度法（enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA）试剂盒检测土豆、洋葱、茄子等样本中的三唑磷残留情况，该试剂盒对样本的添加回收率为65%～125%，变异系数＜15%，在4℃或-20℃的保质期仅为6个月，本研究的样本回收率为70.0%～93.5%，批内、批间相对标准偏差＜10%，试剂盒在4℃下能够保存12个月。黄魁英等［21］采用活泼酯法偶联三唑磷半抗原和蛋白，进而免疫小鼠得到三唑磷多克隆抗体，通过建立ELISA方法，该抗体的IC50为10 μg/L，本研究制备的单克隆抗体IC50为6.9 μg/L。韦林洪等［1］利用免疫亲和色谱-高效液相色谱分析稻米中的三唑磷残留量，该方法的相对标准偏差仅为4.44%，但是总体的操作时间超过24 h，无法作为快速检测方法用于基层单位。

3　结论

本研究制备了抗三唑磷单克隆抗体，并研发出相应的ELISA试剂盒，优选出抗原包被浓度和单克隆抗体浓度，试剂盒的标准曲线范围1～81 μg/L，对结球甘蓝的检测限为49.6 μg/kg，回收率为70.0%～93.5%，批内相对标准偏差范围是6.9%～9.7%，批间相对标准偏差范围是7.6%～9.6%。三唑磷单克隆抗体的特异性较好，与毒死蜱、对硫磷的交叉反应率分别为2.3%，3.8%。ELISA试剂盒能够在4℃下保存12个月，主要指标在正常范围内，可见稳定性较好［22］。

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FENG Caiwei1，2，HE Fangyang1，2*，HUANG Jian3，JIA Fangfang1，2，LI Hang1，2
（1.Beijing Kwinbon Biotechnology Company，Beijing 102206，China；2.Beijing Engineering Research Centre of Food Safety Immunodetection，Beijing 102206，China；3.Beijing Agricultural Products Quality Service Station，Beijing 100101，China）

The synthesized triazophos hapten was prepared from a sequence of reactions of triazophos and acetyl chloride.Triazophos monoclonal antibodies werepreparedfromimmuneanimal，andcouldbeusedinELISAkitthatpreparedfortriazophosresiduecontentdetectioninvegetable.The results showedthatthelimitofdetectionoftriazophosELISAkitwas49.6 μg/kg，withIC50valueof6.9μg/L.Theaddingrecoverieswere70.0%-93.5%，and the linear range of triazopos standard curve ranged from 1-81 μg/L，and intra-assay and relative standard deviation was less than 10%.The cross reaction rate with chlorpyrifos，parathion was 2.3%and 3.8%respectively.The stability tests results revealed that the kit could be kept at 4℃for 12 months.

triazophos；monoclonal antibodies；enzyme linked immunosorbent assay kit

TS207.3

0254-5071（2016）06-0165-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.06.035

2015-12-16

贵州省重大科技专项（黔科合重大专项字［2013］6024号）

冯才伟（1978-），男，高级兽医师，硕士，研究方向为食品安全检测技术研究。

何方洋（1969-），男，高级研究员，博士，研究方向为食品安全检测技术研究。