高效液相色谱内标法测定动物饲料中盐酸克伦特罗

邸万山

（辽宁石化职业技术学院应用化学系，辽宁锦州121001）

高效液相色谱内标法测定动物饲料中盐酸克伦特罗

邸万山

（辽宁石化职业技术学院应用化学系，辽宁锦州121001）

以茶碱为内标物，建立高效液相色谱内标法测定禽畜饲料中盐酸克伦特罗的检测方法。样品经三氯乙酸溶液提取，经过Oasia HLB固相萃取小柱（3 mL/60 mg）处理，再用体积分数为5%的甲醇溶液冲洗后，采用Nova-Pak C18色谱柱（3.9 mm×150 mm×5 μm）分离，以乙腈-28 g/L磷酸二氢钠缓冲溶液（25：75，V/V）为流动相进行洗脱，流速0.8 mL/min，检测波长210 nm。结果表明，茶碱在该条件下能够与盐酸克伦特罗分离完全，可以作为测定盐酸克伦特罗的内标物。盐酸克伦特罗的加标回收率为97.8%～99.2%，精密度试验结果的相对标准偏差（RSD）为0.13%，表明该方法操作简单、准确度高、精密度良好，可用于饲料中盐酸克伦特罗含量分析。

高效液相色谱法；内标法；茶碱；盐酸克伦特罗；饲料

盐酸克伦特罗（clenbuterol hydrochloride）又称咳喘素、瘦肉精，是β-肾上腺素兴奋剂，其作用机理和肾上腺素相同。当其用于家畜饲养超过治疗剂量几倍时，可以产生瘦肉含量更高的酮体，加快肉用家畜的生长速度。1990年欧洲发生了食用残留β-兴奋剂的牛肝引起的食物中毒事件后，欧盟颁布了法规禁止β-兴奋剂作为生长促进剂使用［1］。我国农业部已明令禁止在家畜饲料中使用盐酸克伦特罗。关于饲料中β-兴奋剂的检验方法报道较多，其中液相色谱法主要以外标法测定盐酸克伦特罗［2-3］，而用高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）法内标法测定饲料中盐酸克伦特罗国内外报道较少。

目前国内外对盐酸克伦特罗的有效检测方法主要集中在胶体金快速检测卡法、酶联免疫（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）法、高效液相色谱（HPLC）法和气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）法等。其中高效液相色谱法具有检出限低、动态线性范围宽、精密度高、准确度高、基体效应小、分析速度快等优点，已广泛应用于食品成分分析［4］。本研究目的在于建立高效液相色谱内标法测定饲料中盐酸克伦特罗分析检测方法。样品经三氯乙酸、甲醇提取后，采用Nova-Pak C18色谱柱（3.9 mm×150 mm×5 μm）分离，以乙腈-磷酸二氢钠为流动相进行洗脱，紫外检测波长210 nm，以茶碱为内标物对饲料中盐酸克伦特罗进行了测定，以期为饲料的质量评价提供参考依据。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

饲料：市售；乙腈、甲醇（均为色谱纯），磷酸二氢钠（NaH2PO4）、乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraaceticacid，EDTA）、三氯乙酸（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；盐酸克伦特罗、茶碱对照品（纯度为99.99%）：中国药品生物制品检定所；超纯水（电阻率为18.2 MΩ·cm，0.45 μm膜过滤）：实验室自制。

1.2仪器与设备

810型高效液相色谱仪：美国Waters公司；KQ-700DB数控超声波清洗机：昆山市超声仪器有限公司；Milli-Q超纯水系统：美国Millipore公司；AUW120D电子分析天平：日本岛津公司；Oasia HLB固相萃取小柱（3 mL/60 mg）：上海禾工科学仪器有限公司；TG16B台式高速离心机：盐城市凯特实验仪器有限公司。

1.3试验方法

1.3.1色谱检测条件

色谱柱：Nova-Pak C18（3.9 mm×150 mm×5 μm）；流动相：乙腈-28 g/L磷酸二氢钠缓冲溶液（25∶75，V/V）；流速：0.8 mL/min；进样体积：10 μL；灵敏度：0.2 AUFS；柱温：30℃；检测波长：210 nm。

1.3.2溶液的配制

缓冲溶液的配制：称取2.8 g NaH2PO4，加水定容至100 mL；称取2.1 g柠檬酸，加水定容至100 mL；向NaH2PO4溶液中加入柠檬酸溶液，并调节溶液pH=4.0，再将6.1 gEDTA加入上述缓冲溶液中至完全溶解。

流动相缓冲溶液的配制：称取1.6 g NaH2PO4加水溶解至1 000 mL，加入磷酸调节至溶液pH=2.5，再加入0.4 g EDTA，溶解后过0.45 μm滤膜过滤。

1.0000 mg/mL茶碱、盐酸克伦特罗混合标准储备溶液的配制：准确称取茶碱、盐酸克伦特罗对照品各0.100 00 g，加适量甲醇溶解，转移至100 mL容量瓶中加甲醇定容，摇匀，超声波脱气。

10 μg/mL茶碱、盐酸克伦特罗混合标准使用溶液的配制：用移液管准确移取1.00 mL标准储备溶液于100 mL容量瓶中，加甲醇定容，超声波脱气。

1.3.3试样的处理

准确称取5.000 0 g试样，粉碎后置于50 mL聚四氟乙烯离心管中，加入25 mL缓冲溶液，2 mL 50%三氯乙酸溶液，混匀后，7 500 r/min离心10 min，上清液用滤纸过滤，向残渣中加入10 mL缓冲溶液，经超声波振荡提取10 min，7 500 r/min离心10 min，过滤，重复一次，合并滤液。将滤液通过预先处理好的OasiaHLB固相萃取小柱（3 mL/60 mg），再用20 mL 5%甲醇溶液冲洗，最后用5 mL甲醇洗脱，收集解析液加入0.001 0 mg茶碱，定容至100 mL。经0.45 μm滤膜过滤，超声波脱气后供HPLC分析。

1.3.4盐酸克伦特罗的定性分析

将茶碱、盐酸克伦特罗混合标准使用溶液及试样处理液10 μL在相同的色谱条件下分别注入高效液相色谱仪进行分析，以标准溶液色谱峰的保留时间为依据对试样处理液中的成分进行定性分析。

1.3.5试样中盐酸克伦特罗的定量分析［5-6］

取茶碱、盐酸克伦特罗混合标准使用溶液10 μL注入高效液相色谱仪进行分析，得到茶碱、盐酸克伦特罗的峰面积，计算盐酸克伦特罗对茶碱的相应对响应值。盐酸克伦特罗对茶碱的相对响应值计算公式如下：

式中：Sa1表示盐酸克伦特罗对茶碱的相对响应值；Aa1、As分别为混合标准使用溶液中盐酸克伦特罗、茶碱的峰面积；Wa1、Ws分别为混合标准使用溶液中盐酸克伦特罗、茶碱的质量，g。

取试样处理液10 μL，注入高效液相色谱仪进行分析，得到盐酸克伦特罗、茶碱的峰面积，根据相对响应值计算试样中盐酸克伦特罗的质量。试样中盐酸克伦特罗含量的计算公式如下：

式中：W样.盐酸克伦特罗表示试样中盐酸克伦特罗的质量，g；A样.盐酸克伦特罗表示试样中盐酸克伦特罗的峰面积；W样.茶碱表示试样中茶碱的质量，g；A样.茶碱表示试样中茶碱的峰面积；Sa1表示盐酸克伦特罗对茶碱的相对响应值；W样表示试样的质量，g；10-3表示单位换算系数。

2　结果与分析

2.1检测波长的确定

根据参考文献［7-10］，茶碱、盐酸克伦特罗分别在波长204 nm、210 nm处有较大紫外吸收，在此基础上，在波长200～400 nm进行紫外光谱扫描，结果如图1所示。

图1　茶碱、盐酸克伦特罗紫外吸收光谱Fig.1 Ultraviolet absorption spectrum of theophylline and clenbuterol hydrochloride

由图1可知，茶碱、盐酸克伦特罗2种物质在波长210 nm处都有明显吸收。因此，选择210 nm作为检测波长。

2.2标准品及样品HPLC色谱图及内标物的选择［11-15］

采用高效液相色谱法对混合标准溶液及待测样品按照色谱工作条件的要求进行检测，所得到的茶碱、盐酸克伦特罗的色谱图如图2所示。

图2　茶碱、盐酸克伦特罗混合标准溶液（A）、样品（B）及加标样品（C）HPLC色谱图Fig.2 HPLC chromatogram of theophylline and clenbuterol hydrochloride mixed standard solution（A），samples（B）and samples with standard（C）

由图2可知，在相同色谱条件下同一物质具有相同的保留值。图2A是混合标准品盐酸克伦特罗、茶碱色谱图，两种物质能够完全分离，茶碱的产生的峰面积与盐酸克伦特罗的峰面积匹配性＞75%。图2B是样品色谱图，只有一个盐酸克伦特罗色谱峰，说明样品中不含有内标物茶碱。图2C是样品加标色谱图，盐酸克伦特罗、茶碱两个色谱峰的分离效果较好。因此，茶碱可以作为测定盐酸克伦特罗的内标物。

2.3精密度的测定

取茶碱、盐酸克伦特罗混合标准使用溶液，平行进样5次，检测到盐酸克伦特罗对茶碱的相对响应值分别为1.326、1.314、1.313、1.315、1.312，平均值为1.316，测定结果的相对标准偏差（relativestandarddeviation，RSD）为0.13%。结果显示，该方法的精密度良好，能满足饲料中盐酸克伦特罗的分析要求。

2.4方法的加标回收率试验

在已知含量的饲料样品处理液中分别加入盐酸克仑特罗0.050 mg/kg、0.100 mg/kg、0.150 mg/kg 3个质量浓度添加水平，进行加标回收率试验，每个样品平行测定3次，已知含量的试样中分别加入不同质量浓度的的茶碱、盐酸克伦特罗标准溶液进行回收率试验，结果见表1。由表1可知，盐酸克伦特罗的回收率为97.8%～99.2%，RSD为0.16%，结果表明，该方法准确度高，可用于饲料中盐酸克伦特罗的检测。

表1　加标回收率试验结果Table 1 Results of adding standard recovery rate tests

2.5方法检出限

将茶碱、盐酸克伦特罗标准溶液逐步稀释，并在相同色谱条件下对其进行测定，以各物质的色谱峰峰面积相当于基线噪声的3倍信噪比为标准，计算检出限（S/N=3），结果见表2。由表2可知，茶碱、盐酸克伦特罗检出限分别为0.33 μg/kg和0.25 μg/kg，能够满足饲料中盐酸克伦特罗的测定要求。

表2　茶碱、盐酸克伦特罗检出限Table 2 Detection limit of theophylline and clenbuterol hydrochloride

3　结论

本研究以茶碱作内标物，采用高效液相色谱内标法测定饲料中盐酸克伦特罗，由于待测液中盐酸克伦特罗与内标物茶碱组成恒定，避免了由于进样体积、检测器灵敏度、流速以及流动相组成发生变化对测定结果的影响。因此，内标法较外标法具有准确度高、重现性好的优点。结果表明，样品经三氯乙酸溶液提取、Oasia HLB固相萃取小柱（3 mL/60 mg）处理和甲醇溶液冲洗后，采用Nova-Pak C18色谱柱（3.9 mm×150 mm×5 μm）分离，以流速0.8 mL/min的流动相乙腈-28 g/L磷酸二氢钠缓冲溶液（25∶75，V/V）洗脱后，在检测波长210 nm处检测，茶碱和盐酸克仑特罗的分离效果较好，盐酸克伦特罗加标回收率为97.8%～99.2%，相对标准偏差（RSD）为0.16%，精密度试验结果RSD值为0.13%，盐酸克伦特罗的检出限为0.25 μg/kg。说明该方法精密度良好、准确度高、检出限低，可实现饲料中盐酸克伦特罗的测定。为进一步研究盐酸克伦特罗安全性评价提供理论依据。

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DI Wanshan
（Department of Applied Chemistry，Liaoning Petrochemical Vocational and Technical College，Jinzhou 121001，China）

With the theophylline as internal standard，the detection method of clenbuterol hydrochloride in animal feedstuffs was established by HPLC. Samples were extracted by trichloroacetic acid solution，treated by Oasia HLB solid-phase extraction column（3 ml/60 mg），washed by 5%methanol solution，separated by Nova-Pak C18column（3.9 mm×150 mm×5 μm），eluted by acetonitrile-28 g/L sodium dihydrogen phosphate buffer（25：75，V/V）as mobile phase，with flow rate of 0.8 ml/min，determine wavelength of 210 nm.Results showed that under the conditions，theophylline could was separated with clenbuterol hydrochloride completely，could be used as an internal standard of determination of clenbuterol hydrochloride.The adding standard recovery rate of clenbuterol hydrochloride was 97.8%-99.2%.The relative standard deviation（RSD）of precision tests results was 0.13%.Due to the simple operation，high accuracy and good precision，the method can be used for clenbuterol hydrochloride content analysis in feedstuffs.

HPLC；internal standard method；theophylline；clenbuterol hydrochloride；feedstuffs

TS207.3

0254-5071（2016）06-0170-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.06.036

2016-03-02

邸万山（1966-），男，副教授，本科，研究方向为食品分析、工业分析和环境分析。