NaHCO3胁迫下白桦四倍体表型及生理分析

穆怀志，林　琳，于建国，姜效龙，张　骁，夏富才

(1.北华大学林学院，吉林 吉林　132013；2.中国林业科学研究院寒温带林业研究中心，黑龙江 哈尔滨　150086；3.国家林业局哈尔滨林业机械研究所，黑龙江 哈尔滨　150086；4.吉林市龙潭区新山苗木专业合作社，吉林 吉林　132206；5.吉林省林业勘察设计研究院，吉林 长春　130022)



NaHCO3胁迫下白桦四倍体表型及生理分析

穆怀志1，林琳2，3，于建国4，姜效龙4，张骁5，夏富才1

(1.北华大学林学院，吉林 吉林132013；2.中国林业科学研究院寒温带林业研究中心，黑龙江 哈尔滨150086；3.国家林业局哈尔滨林业机械研究所，黑龙江 哈尔滨150086；4.吉林市龙潭区新山苗木专业合作社，吉林 吉林132206；5.吉林省林业勘察设计研究院，吉林 长春130022)

采用NaHCO3胁迫处理白桦四倍体苗木，测定其表型特征及生理特性.结果表明：在NaHCO3胁迫下，白桦四倍体叶片受盐害程度明显低于二倍体，苗高和地径生长明显高于二倍体；白桦四倍体净光合速率、可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、脯氨酸含量、超氧化物歧化酶活性和过氧化物酶活性始终显著高于二倍体.

白桦；四倍体；胁迫响应

【引用格式】穆怀志，林琳，于建国，等．NaHCO3胁迫下白桦四倍体表型及生理分析[J].北华大学学报(自然科学版)，2016，17(5)：585-589.

土壤盐碱化是影响农林业生产和生态环境的严重问题.全球盐碱地面积占陆地总面积的1/3以上，并且呈逐年增加的趋势[1].如何利用大面积盐碱地发展农林业，是国际上迫切需要解决的重大课题.进行盐碱地改良日益受到淡水资源短缺的限制，而培育耐盐新品种是开发和利用盐碱地的有效途径.采用传统方法培育耐盐新品种虽然简便可行，但进展缓慢，至今尚未培育出真正的耐盐品种.随着育种技术的发展，人们希望利用新技术迅速培育出具有一定耐盐性的植物新品种，为盐碱地区的农林业生产和生态环境建设服务.

多倍化是植物进化历史中的普遍现象.从植物地理分布上看，多倍体大多出现在高纬度、高海拔等气候环境变化剧烈地区，说明植物多倍体比二倍体具有更强的适应不利自然条件的能力[2].目前，在木本植物中，以杨树(Populus)和刺槐(Robinia)多倍体抗逆育种的成效最为显著，培育出的多倍体品种与二倍体相比，表现出抗旱、耐盐、抗病等特点，在生产上早已推广应用[3-6].

桦木属(Betula)植物作为分布广泛的重要用材树种[7]，其倍性育种研究始于20世纪40年代[8]，培育出的欧洲白桦(B.verrucosa)与毛桦(B.pubescens)杂种三倍体在抗病性上显著优于二倍体[9].此后，就再未见到桦木多倍体用于生产的报道.作者在2012年采用Solexa技术测定白桦四倍体和二倍体转录组时发现，白桦四倍体在胁迫响应方面与二倍体存在显著差异，这些差异暗示白桦四倍体的抗逆性可能强于白桦二倍体[10].针对这一问题，我们对来源于同一家系的白桦四倍体和二倍体进行NaHCO3胁迫，通过对苗木表型特征和生理特性的研究，分析白桦四倍体与白桦二倍体的耐盐性是否存在显著差异，以期为通过倍性育种创造材质好、抗逆性强、高产等优良性状为一体的白桦良种提供参考.

1　材料及方法

1.1供试材料

用秋水仙素处理来自同一家系的白桦种子，同时设置非处理水对照.将萌发的种子在育苗杯中育苗后进行倍性鉴定[11]，分别获得白桦四倍体76株和二倍体70株，将这些苗木移栽到直径15cm、高20cm的塑料花盆中进行常规水肥管理.分别随机选取白桦四倍体和二倍体各20株进行0.8%NaHCO3胁迫处理，每3d胁迫1次，每次用2L溶液.

1.2盐害指数及相对生长量测定

NaHCO3胁迫12d后，调查苗木叶片的盐害指数.其中，无盐害现象为0级；轻度盐害(叶片边缘变黄或有少量黄点)为1级；中度盐害(叶片约1/2面积出现枯黄)为2级；重度盐害(叶片约3/4面积出现枯黄)为3级；极重度盐害(叶片全部变黄、焦枯或脱落)为4级.盐害指数 = ∑(盐害级值 × 相应盐害级值的叶片数量)/总叶片数量[12].

胁迫前，测定白桦四倍体和二倍体的苗高和地径，并记为基值.胁迫处理后进行正常水肥管理.苗木停止生长后，再次测定白桦四倍体和二倍体的苗高和地径，并记为终值.相对生长量 =(终值-基值)/基值 × 100%[13].同时测定非胁迫条件下白桦四倍体和二倍体苗高及地径的相对生长量.

1.3光合作用测定

分别于NaHCO3胁迫0，3，6，9和12d选取每株白桦四倍体和二倍体顶端第3片叶片，利用光合仪(LI-6400，LI-COR，USA)在光强1 000μmol/(m2·s)、CO2浓度400μmol/mol、叶片温度30 ℃条件下分别测定净光合速率和蒸腾速率，计算水分利用率：水分利用率=净光合速率/蒸腾速率[14].

1.4生理指标测定

摘取测定光合作用的叶片于液氮速冻后置于-80 ℃冰箱中保存，利用分光光度计(722，TP，China)分别测定白桦四倍体和二倍体在NaHCO3胁迫下0，3，6，9和12d的可溶性糖含量[15]、可溶性蛋白含量[15]、脯氨酸含量[16]、丙二醛含量[17]、超氧化物歧化酶(SOD)活性[18]和过氧化物酶(POD)活性[19].

2　结果与分析

2.1盐害指数与相对生长量

NaHCO3胁迫后，有的白桦四倍体和二倍体叶片出现变黄、焦枯和脱落现象，白桦四倍体的叶片盐害指数显著低于白桦二倍体，仅为1.58，比二倍体低31.15%(图1).苗木停止生长后，分别测定非胁迫和胁迫条件下白桦四倍体和二倍体苗高及地径的相对生长量.结果表明：在非胁迫条件下，白桦四倍体苗高和地径的相对生长量分别比二倍体低34.80%和2.80%(图2a)；在NaHCO3胁迫条件下，白桦四倍体苗高和地径的相对生长量明显高于二倍体，达到20.19%和18.44%，分别比二倍体高41.29%和106.26%(图2b).以上结果说明：在NaHCO3胁迫下，白桦四倍体的叶片受盐害程度明显低于二倍体，苗高和地径生长明显高于二倍体，苗木整体呈现出较强的耐盐性.

2.2光合作用

测定NaHCO3胁迫过程中白桦四倍体和二倍体的叶片净光合速率和蒸腾速率，计算水分利用率，见图3.结果表明：随着胁迫时间的延长，白桦四倍体和二倍体的净光合速率和蒸腾速率呈下降趋势，水分利用率呈上升趋势.在净光合速率方面，胁迫前四倍体的净光合速率达到19.87μmol/(m2·s)，比二倍体高29.53%.胁迫12d后，四倍体的净光合速率虽降至10.09μmol/(m2·s)，但仍比二倍体高20.55%；在蒸腾速率方面，胁迫前四倍体的蒸腾速率为6.24mmol/(m2·s)，比二倍体高19.77%，胁迫后降至1.78mmol/(m2·s)，与二倍体差异不显著；在水分利用率方面，胁迫前四倍体的水分利用率为2.80mmol/mol，与二倍体差异不显著，胁迫后升至5.78mmol/mol，比二倍体高12.45%.

2.3主要生理指标

测定NaHCO3胁迫过程中白桦四倍体和二倍体的可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、脯氨酸含量、丙二醛含量、SOD活性和POD活性，见图4.结果表明：在可溶性糖和可溶性蛋白含量方面，四倍体和二倍体均呈下降趋势，且四倍体始终高于二倍体.胁迫前四倍体的可溶性糖质量分数和可溶性蛋白质量分数分别为1.10mg/g和2.62mg/g，比二倍体高94.19%和36.28%，胁迫后虽然均有所下降，但仍比二倍体高123.70%和133.93%；在丙二醛含量方面，四倍体和二倍体均呈上升趋势，胁迫前四倍体和二倍体的丙二醛含量差异不显著，胁迫后四倍体的丙二醛质量摩尔浓度升至9.06μmol/g，比二倍体低36.64%；在脯氨酸含量、SOD活性和POD活性方面，四倍体和二倍体均呈先上升后下降的趋势，且四倍体始终高于二倍体.其中，四倍体在胁迫第9天时的脯氨酸质量分数、SOD活性和POD活性达到最大，分别为17.59μg/g，20.66U/g和15.79U/g，比二倍体高114.51%，39.69%和90.01%.

3　结论与讨论

植物多倍体的特点不仅体现在提高生长速度和增加代谢产物上，在抗旱、耐盐、抗病等方面，多倍体与二倍体相比也表现出明显的优势.美洲白桦五倍体与二倍体相比具有较强的抗旱性[20]，欧洲白桦与毛桦的杂种三倍体在抗病性上显著优于二倍体[9].本次研究通过NaHCO3胁迫白桦四倍体发现：与二倍体相比，白桦四倍体的受盐害程度明显降低，苗高和地径的相对生长量明显升高，苗木整体呈现出较强的抗盐性.

光合作用是植物体内极为重要的代谢过程，它的强弱对于植物生长、生殖和抗逆性均有十分重要的影响[21].有研究表明，在非胁迫条件下，白桦四倍体的光合作用与二倍体存在明显差异，其最大净光合速率、光饱和点和羧化效率分别比二倍体高24.81%，9.41%和25.19%[22].本项研究结果表明：在NaHCO3胁迫下，虽然白桦四倍体的净光合速率有所下降，但仍始终高于二倍体；水分利用率的不断上升，也说明白桦四倍体对于盐胁迫具有较强的适应能力，该结果与美洲白桦多倍体的研究结果大致相同[20].

活性氧是氧化能力很强的几种含氧物质的总称，当植物遭遇逆境胁迫时，细胞中活性氧积累及其过氧化作用被认为是胁迫伤害的一个重要机制[23].作为主要的抗氧化酶，SOD和POD担负着淬灭活性氧的任务，这些保护酶的水平与植物的抗盐性有很大关系[24-25].此外，盐渍条件下的植物要受到渗透胁迫的伤害，若要减轻或避免这种伤害，植物需要在细胞中积累脯氨酸等渗透调节剂进行调节[26].本次研究发现：在NaHCO3胁迫过程中，白桦四倍体的脯氨酸含量、SOD活性和POD活性在9d之前均呈现出上升趋势，说明这些物质在四倍体对抗盐胁迫过程中发挥了作用；9d以后，脯氨酸含量、SOD活性和POD活性均有所下降，可能是由于胁迫时间过长，脯氨酸和抗氧化酶的合成系统受到破坏引起的.另外，在胁迫过程中，白桦四倍体的可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、脯氨酸含量、SOD活性和POD活性始终高于二倍体，且四倍体脯氨酸含量和POD活性持续上升的时间比二倍体长3d，这些都是造成白桦四倍体抗盐性增强的原因.

有研究表明，白桦四倍体在刺激响应、胁迫响应、植物与病原体相互作用等方面的基因表达与二倍体存在显著差异[10].因此，下一步要对白桦四倍体与抗逆相关的基因进行克隆和功能验证，为揭示其抗逆机理提供资料，从而更加准确、全面地反映白桦四倍体的抗逆性.

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【责任编辑：郭伟】

Morphology and Physiology of Autotetraploid Betula platyphyllaRespondingtoNaHCO3Stress

Mu Huaizhi1，Lin Lin2，3，Yu Jianguo4，Jiang Xiaolong4，Zhang Xiao5，Xia Fucai1

(1.Forestry College of Beihua University，Jilin 132013，China；2.Research Center of Cold Temperate Forestry，Chinese Academy of Forestry，Harbin 150086，China；3.Harbin Research Institute of Forestry Machinery，China State Forestry Administration，Harbin 150086，China；4.Xinshan Nursery Stock Cooperative of Longtan District of Jilin City，Jilin 132206，China；5.Forest Survey and Design Institute of Jilin Province，Changchun 130022，China)

ToevaluatetheimpactofintraspeciesgenomeduplicationonNaHCO3stress，aseriesofBetula platyphyllaautotetraploidsanddiploidsweregeneratedfromthesamefamily.Themorphologyandphysiologyoftheseautotetraploidindividualswerecomparedwiththosediploidtrees.Autotetraploidsweresuperiorininjuryindexandrelativegrowthofheightandbasediametercomparedtodiploids.Physiologicaldatarevealedautotetraploidsweregenerallyhigherexpressioninnetphotosyntheticrate，solublesugarcontent，solubleproteincontent，prolinecontent，superoxidedismutaseactivityandperoxidaseactivity.

Betula platyphylla；autotetraploid；stressresponse

1009-4822(2016)05-0585-05

10.11713/j.issn.1009-4822.2016.05.006

2016-04-25

吉林省教育厅科学技术研究项目(2015139)；北华大学博士科研启动基金.

穆怀志(1985-)，男，博士，讲师，硕士生导师，主要从事林木遗传育种研究，E-mail:huaizhimu@126.com；

夏富才(1973-)，男，博士，副教授，硕士生导师，主要从事植物学研究，E-mail:xfc0707@163.com．

S722.35

A