补肾活血汤对SD大鼠骨折愈合过程中结缔组织生长因子表达的影响

程英雄，罗毅文，王斌，吴志方，庄洪

1.广州中医药大学附属骨伤科医院，广东 广州 510240；2.广州中医药大学第一附属医院，广东 广州 510405

补肾活血汤对SD大鼠骨折愈合过程中结缔组织生长因子表达的影响

程英雄1，罗毅文1，王斌1，吴志方1，庄洪2

1.广州中医药大学附属骨伤科医院，广东 广州 510240；2.广州中医药大学第一附属医院，广东 广州 510405

目的：探讨补肾活血法对SD大鼠骨折愈合过程中结缔组织生长因子表达的影响。方法：清洁级SD大鼠40只，6月龄，随机分为对照组（A组）及补肾活血汤组（B组），建立骨折模型。A组大鼠灌胃蒸馏水，B组大鼠灌胃补肾活血汤溶液，灌胃给药容积为10 mL/kg。造模后第3、7、14、21天，每组随机选取5只大鼠，切取骨痂标本，采用RT-PCR法和Western-blot法分别检测结缔组织生长因子（CTGF）的mRNA和蛋白质的表达。结果：结果显示，A组术后3天、7天及14天的CTGF mRNA和蛋白的表达逐渐增强，至21天表达下降，与术后14天比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。术后3天，B组CTGF mRNA和蛋白无表达，术后7天、14天及21天，B组的CTGF mRNA和蛋白的表达逐渐增强，术后21天与术后14天比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。术后21天，B组较A组的CTGF mRNA和蛋白的表达均显著升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。结论：补肾活血能够促进骨折愈合过程中结缔组织生长因子蛋白和mRNA表达，从而促进骨折愈合。

补肾活血汤；骨折愈合；结缔组织生长因子（CTGF）；蛋白质；动物实验；大鼠

立足于骨折的三期辨证，早期气滞血瘀、中期营血不和及晚期的肝肾亏虚，多采用中药补肾活血法治疗，临床经典方补肾活血汤具有此功效。结缔组织生长因子（CTGF）在骨折愈合方面发挥着重要作用，有研究显示，CTGF促进软骨细胞和成骨细胞的增殖、分化，从而对骨折愈合产生直接影响［1］。因此，本研究采用补肾活血汤，探讨补肾活血法对SD大鼠骨折愈合过程中结缔组织生长因子表达的影响，现报道如下。

1　材料和方法

1.1实验动物与分组清洁级雄性SD大鼠40只，6月龄，体重260～300g，由广州中医药大学动物实验室中心提供，实验动物合格证号：6020911，随机分为2组：对照组（A组）、补肾活血组（B组），每组20只。

1.2主要试剂与仪器蛋白裂解液、30%丙烯酰胺、Tris（三羟甲基氨基甲烷）、SDS（十二烷基硫酸钠）、甲醇、过硫酸铵、TEMED（四甲基乙二胺）、PVDF膜（聚偏二氟乙烯膜）、脱脂奶粉、预染marker购自碧云天；内参蛋白GAPDH（甘油醛-3-磷酸脱氢酶）、CTGF兔多克隆抗体、山羊抗兔IgG二抗购自武汉博士德；ECL荧光试剂盒购自Pierce；RT-PCR试剂盒购自上海罗氏公司；紫外/核酸蛋白检测仪（Nano-Drop）；垂直电泳仪（Baygene）。

1.3药物的制备中药补肾活血汤，处方：熟地黄、菟丝子、补骨脂各18 g，杜仲、肉苁蓉、枸杞子、山萸肉、独活、当归、没药各6 g，红花3 g，所有中药材由由广州中医药大学附属骨伤科医院药房提供。将中药材990 g（共10剂）放入铝锅中，加入5000 mL蒸馏水常温下浸泡24 h后，加热沸腾，文火煎煮3 h，用一层纱布过滤得到3820 mL药液，分装后，4℃保存。

1.4造模方法与标本的采集以10%水合氯醛按0.133 mL/100 g腹腔注射麻醉，2组均行闭合性股骨干骨折术［1］：麻醉后，取俯卧式，碘酒、酒精消毒右下肢膝关节皮肤，作膝关节内侧纵行切口，约1 cm，切开皮肤、皮下，暴露关节腔，将髌骨向外侧推开，极度屈曲膝关节，暴露髁间窝，摇钻将0.8 mm无菌克氏针打入股骨髓腔内，近段至粗隆下，远端不超过关节面，避免阻碍关节的自由活动。关节腔内滴入少量青霉素水溶液，缝合切口，将右股骨置于骨折发生装置下，股骨的中点与骨折发生装置的打击器对应，并且所有垂直打击力量通过弹簧长度保持一致。手术均在严格无菌条件下进行，术后根据分组放至笼中自由活动与进食。术后连续3天，青霉素肌肉注射预防感染。术后第1天开始，A组大鼠灌胃蒸馏水，B组大鼠灌胃补肾活血汤溶液，灌胃给药容积为10 mL/kg，每毫升相当于0.259 g原药材，相当于临床给药剂量的5倍，每天1次，直到实验结束。术后第3、7、14、21天，每组随机选取5只大鼠，切取骨痂标本，液氮保存。

1.5RT-PCR法检测CTGF mRNA液氮研磨，组织块直接放入研钵中，加入少量液氮，迅速研磨，待组织变软，再加少量液氮，再研磨，如此三次，应用Trizol试剂盒提取总RNA。CTGF的引物序列为：上游引物：5’-GAGTGGGTGTGTGAC GAGCCCAAGG-3’，下游引物：5’-ATGTCTCCGTACATCTT CCTGTAGT-3’，PCR产物为499 bp。PCR反应体系为20 μL，PCR循环参数为：94℃预变性3 min，94℃变性30 s，54℃退火30 s，72℃复性30 s，共35个循环，最后72℃延伸7 min。每次PCR反应均以无菌双蒸水代替cDNA模板作为阴性对照。实时荧光定量，计算机分析各组CT值。

1.6Western blot印迹法检测CTGF蛋白的表达取各组的组织块研磨，提取总蛋白。将各组蛋白样品加loading buffer煮沸变性，并进行SDS-PAGE凝胶电泳，电转移至PVDF膜上进行转膜，用5%BSA封闭液封闭1 h，分别用GAPDH、CTGF一抗抗体试剂盒稀释浓度的适当量4℃孵育过夜。后加入羊抗兔二抗，室温反应1 h，洗膜后，在曝光房内，将PVDF膜用超敏发光液孵育1 min，用X-ray曝光显影条带。Image J分析条带灰度值，以CTGF/GAPDH表示蛋白表达量。1.7统计学方法所有数据采用SPSS19.0统计软件进行分析，计量资料用（±s）表示，2组间比较用t检验。多组间比较用单因素方差分析，方差齐，则用LSD；方差不齐用Dunett T3比较。

2　结果

2.12组大鼠四个时相CTGF mRNA表达情况比较见表1，图1。RT-PCR结果显示，A组术后3天、7天及14天的CTGF mRNA表达逐渐增强，至21天表达下降，与术后14天比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。术后3天，B组CTGF mRNA无表达，术后7天、14天及21天，B组的CTGF mRNA表达逐渐增强，在21天时，与术后14天比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。在术后21天时，B组与A组CTGF mRNA表达含量比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。

表1　2组大鼠四个时相CTGF mRNA表达情况比较（±s）

表1　2组大鼠四个时相CTGF mRNA表达情况比较（±s）

与同组前一个时间点比较，①P＜0.05；21 d时，与A组比较，②P＜0.05

组别A组B组3 d 0.3051±0.05445 0.002693±0.000553 7 d 0.5088±0.0224 0.3268±0.04388 14 d 0.8128±0.03051 0.5152±0.3306 21 d 0.4309±0.3206①0.8282±0.3598①②

2.22组大鼠四个时相CTGF蛋白表达情况比较见表2，图2。Western Blot法结果显示，A组术后3天、7天及14天的CTGF蛋白表达逐渐增强，至21天表达下降，与术后14天比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。术后3天，B组无表达，术后7天、14天及21天，B组的CTGF蛋白表达逐渐增强，在21天时，与术后14天比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。在术后21天时，B组与A组CTGF蛋白表达含量比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。

图1　2组大鼠四个时相CTGF mRNA表达情况

表2　2组大鼠四个时相CTGF蛋白表达情况比较（±s）

表2　2组大鼠四个时相CTGF蛋白表达情况比较（±s）

与同组前一个时间点比较，①P＜0.05；21 d时，与A组比较，②P＜0.05

组别A组B组3 d 0.2651±0.02211 0.003693±0.000553 7 d 0.3988±0.01241 0.2402±0.02449 14 d 1.3934±0.06191 0.3219±0.02286 21 d 0.2759±0.02081①1.3561±0.03132①②

图2　2组大鼠四个时相CTGF蛋白表达情况

3　讨论

结缔组织生长因子是一种多功能的生长因子，参与体内多种病理生理过程，在胚胎发育、肿瘤形成、动脉粥样硬化、纤维化疾病以及骨折愈合中发挥重要作用。CTGF作为一种重要的效应分子，在软骨细胞和成骨细胞的增殖、分化方面发挥重要作用，对骨折愈合产生直接而重要的影响［1］。

Nakanishi等的研究结果显示，CTGF mRNA的过表达可促进软骨细胞株HCS-2/8细胞增殖，并促进软骨聚集蛋白多糖分泌和X型胶原表达［2］。欧阳冰等人采用MTT及SABC法观察CTGF生长因子对体外培养的兔关节软骨细胞增殖和表型的影响，结果显示100 μg/L的CTGF生长因子作用软骨细胞7天的增殖效果最好，而SABC检测到经CTGF刺激组的细胞Ⅱ型胶原表达较空白对照组有显著差异［3］。Nishida等研究表明rCTGF可轻度促进人骨肉瘤SaOS-2细胞和小鼠前成骨细胞—MC3T3-E1细胞的增殖，同时rCTGF可上调骨基质蛋白如I型胶原、骨桥素和骨钙素mRNA的表达，而且rCTGF可上调ALP的基因表达并增强其活性，而ALP是成骨细胞分化的一种标志物［4］。Amott JA等［5］人研究显示，CTGF通过激活avb5整合素转导，调控成骨细胞样细胞系的胞内激酶活性，从而促进局部黏附蛋白的形成和肌动蛋白细胞骨架的重构。Safadi FF等［6］发现，抗CTGF治疗可抑制骨基质的矿化和结节形成，其抑制钙盐沉积的作用呈剂量依赖性。另外CTGF在骨质樱花大鼠中呈过表达，同时该大鼠表现为破骨细胞功能缺陷，骨密度明显增高，骨基质和骨矿化相关基因高表达。上述研究结果提示，CTGF可能在正常骨塑建和骨重建中发挥某些作用。

本次实验研究采用RT-PCR方法检测CTGF基因的mRNA表达，从核酸角度来分析基因的表达情况，并结合CTGF核酸的产物蛋白质，从蛋白水平来分析基因的表达情况。通常从核酸和蛋白两个层次来分析，可以得到更为确定的基因表达结果，更详细、更直观地说明基因表达的情况。实验结果显示：术后3天、7天和14天，补肾活血汤组的CTGF mRNA和蛋白表达较对照组低，在前三个时相中，2组大鼠CTGF的mRNA和蛋白表达均依次提高；在术后21天，补肾活血汤组较对照组的mRNA和蛋白表达显著性增加，而对照组则在第四个时相中CTGF表达较第三个时相降低。根据实验结果，我们分析认为补肾活血汤能促进CTGF的表达主要在7天、14天和21天，而在21天时最明显，从而促进骨折愈合，与Nakata E等［7］研究结果相近。

CTGF mRNA及其蛋白产物的表达在骨骼发育以及骨量维持方面发挥重要作用。因此，进一步研究CTGF对骨骼发育和骨重建的作用，以及开发促进和（或抑制）CTGF的药物，有助于进一步的了解骨质疏松性骨折的愈合机制，并为其防治提供新的策略。综上所述，在骨折愈合过程中，辨证使用补肾活血化瘀中药，能够促进骨折愈合过程中软骨骨痂向骨性骨痂转化的步骤，从而促进骨折愈合，这一结果对临床骨折愈合治疗及研究有一定的指导意义。

［1］ Aoyama E，Kubota S，Khattab HM，et al.CCN2 enhances RANKL-induced osteoclast differentiation via direct binding to RANK and OPG［J］.Bone，2015（73）：242-248.

［2］Nakanishi T，Nishida T，Shimo T，et al.Effects of CTGF/Hcs24，a product of a hypertrophic chondrocytespecific gene，on the proliferation and differentiation of chondrocytes in culture［J］.Endocrinology，2000，141（1）：264-273.

［3］欧阳冰，林绵辉，左文建，等.结缔组织生长因子对体外培养的兔关节软骨细胞增殖和表型的影响［J］.中国组织工程研究与临床康复，2009，13（20）：3816-3820.

［4］Nishida T，Kubota S，NakanishiT，et al.CTGF/Hcs24，ahypertrophicchondrocyte-specificgeneproduct，stimulatesproliferationanddifferentiation， butnot hypertrophy of cultured articular chondrocytes［J］.J Cell Physiol，2002，192（1）：55-63.

［5］ Arnott JA， Zhang X， Sanjay A， et al.Molecular requirementsfor inductionof CTGF expressionby TGF-beta1 in primary osteoblasts［J］.Bone，2008，42（5）：871-885.

［6］ Safadi FF，Xu J，Smock SL，et al.Expression of connective tissue growth factor in bone：its role in osteoblast proliferation and differentiation in vitro and bone formation in vivo［J］.J CellPhysiol，2003，196（1）：51-62.

［7］Nakata E，Nakanishi T，Kawai A，et al.Expression of connective tissue growth factor/hypertrophic chondrocyte-specific gene product 24（CTGF/Hcs24）during fracture healing［J］.Bone，2002，31（4）：441-447.

（责任编辑：冯天保，郑锋玲）

R285.5

A

0256-7415（2016）09-0233-03

10.13457/j.cnki.jncm.2016.09.101

2016-05-08

广州中医药大学创新基金（K0070077）

程英雄（1976-），男，副主任中医师，研究方向：骨质疏松性骨折的防治。