hpRNA的制备新方法及其在RNAi载体中的应用

刘晓宁

摘要[目的]验证制备新方法所获得的稳定hpRNA是否可用于RNAi载体的构建并达到基因表达干扰的效果。[方法]利用制备新方法（2 μL DNA与8 μL H2O混匀，95 ℃ 5 min，37 ℃ 15 min）制备hpRNA，后采用REGS方法构建ZmMDAR RNAi载体，通过Grx1roGFP2和荧光实时定量PCR检测基因表达干扰的效果。[结果]利用制备新方法制备50 nt hpRNA。ZmMDAR基因的表达量变化和GrxlroGFP2探针的荧光比值变化表明hpRNA介导的干扰载体引起了原生质体氧化还原状态的变化。[结论]通过制备新方法所制备的hpRNA为RNAi载体所介导的干扰作用奠定基础。

关键词发夹RNA；REGS；ZmMDAR RNAi；Grx1roGFP2

中图分类号Q78文献标识码A文章编号0517-6611（2016）04-175-03

A Prepared Method of hpRNA and Its Application for RNAi Vector

LIU Xiaoning（Medical College，Huanghe S&T College， Zhengzhou， Henan 450063）

Abstract[Objective] The aim was to test a method if it is applied for the RNAi vector and lead to interference effect. [Method] We prepared hpRNA by the new method （2 μL DNA and 8 μL H2O mixed， 95 ℃， 5 min， 37 ℃，15 min）， constructed ZmMDAR RNAi vector with REGS method， and tested the interference effect of gene expression by Grx1roGFP2 and realltime PCR. [Result] Using new method for preparing 50nt hpRNA， change of Zm MDAR expression and fluorescence ratio of GrxlroGFP2 indicated that hpRNA mediated interference vector caused the change of redox state of protoplast. [Conclusion] The prepared hpRNA by new method will lay a foundation for interference effect mediated by RNAi vector.

Key wordshpRNA； REGS； ZmMDAR RNAi； Grx1roGFP2

RNAi（RNA interference，RNA干扰）是一种进化上保守的抵御靶向细胞和病毒mRNAs的dsRNA防御机制，在此生物学过程中，小RNA干扰了mRNA转录本水平，从而最终抑制该基因的表达。非编码小RNAs是miRNA和siRNA的dsRNA前体裂解产物，此裂解过程是通过一种Dicer的核酸酶执行完成。这些非编码小RNAs与RISC[1]、AGO蛋白和其他效应子蛋白共同导致了RNA干扰。

RNAi技术日趋成为一种功能基因組研究的重要手段，Sugao等[2]使用cDNA文库构建了RNAi文库；Dietzl等[3]对每个基因进行单独构建UASIR载体，然后形成RNAi文库的方法构建了果蝇RNAi库。此外，RNAi更有利于细胞信号转导通路的鉴定，利用RNAi文库靶向人类基因组中的mRNA，最终鉴定了p53信号通路的5个新调节者。构建RNAi文库是一个相对较繁琐的过程，迄今为止人们相继发展了几种构建RNAi文库的方法：Sen等[5]利用REGS方法构建了鼠胚胎RNAi文库；Luo等[6]利用DNA酶学工程方法构建了小鼠胚胎siRNA文库；针对单个基因进行单独构建，最后形成RNAi文库[3]；Nichols等[7]以重组酶为基础构建了能产生随机siRNA的RNAi文库；……