复合免疫亲和柱净化—液相色谱—串联质谱法测定动物源食品中6种黄曲霉毒素和6种玉米赤霉醇类真菌毒素残留量

孙雪 郗存显 唐柏彬 王国民 陈冬东 赵华

摘要 建立了动物源食品（猪肉、鱼肉、猪肝）中6种黄曲霉毒素（AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、AFM1和AFM2）和6种玉米赤霉醇类真菌毒素 （α玉米赤霉醇、β玉米赤霉醇、α玉米赤霉烯醇、β玉米赤霉烯醇、玉米赤霉酮和玉米赤霉烯酮）残留量的复合免疫亲和柱净化高效液相色谱串联质谱（HPLCMS/MS）检测方法。样品经β葡萄糖苷酸/硫酸酯复合酶酶解后， 用甲醇乙腈（20∶80， V/V）提取，提取液经玻璃纤维滤纸过滤，滤液用PBS溶液稀释，复合免疫亲和柱富集和净化后，采用HPLCMS/MS法分析。12種目标分析物中AFB2和AFG2的线性范围为0.03～6.0 μg/L，其余目标分析物的线性范围为0.05～20 μg/L，线性相关系数均大于0.999，检出限在0.01～0.03 μg/kg范围内，定量限在0.04～0.09 μg/kg范围内。分别以0.5， 1.0 和5.0 μg/kg添加浓度水平进行方法学验证，平均回收率为73.6%～98.4%，相对标准偏差（RSD）为1.9%～11.2%。本方法简便、灵敏，能够满足动物源食品中痕量黄曲霉毒素和玉米赤霉醇类真菌毒素残留的测定要求。

关键词 动物源食品； 复合免疫亲和柱； 黄曲霉毒素； 玉米赤霉醇类真菌毒素； 高效液相色谱串联质谱

1引言

真菌毒素来源于各种霉菌的次生代谢产物，包含多种化学结构不同的物质。常见的真菌毒素包括T2毒素、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素A、黄曲霉毒素、呕吐毒素等。玉米赤霉烯酮（ZON）是由镰刀霉菌产生的一种雷索酸内酯类真菌毒素，在肠道和肝脏经3α和3β羟基类固醇脱氢酶（HSDs）羟基化，生成α玉米赤霉烯醇（αZOL）、β玉米赤霉烯醇（βZOL），之后进一步还原生成α玉米赤霉醇（αZAL）、β玉米赤霉醇（βZAL）和玉米赤霉酮（ZAN） [1，2 ]，这几种物质与ZON合称为玉米赤霉醇类真菌毒素（Zeranol， ZER）。黄曲霉毒素（Aflatoxins，AFs）是由曲霉菌代谢产生的一组致毒基团相同、化学结构类似的真菌毒素，常见的有黄曲霉毒素G1（AFG1）、黄曲霉毒素G2（AFG2）、黄曲霉毒素B1（AFB1）、黄曲霉毒素B2（AFB2）等，其中AFB1和AFB2可在机体内代谢产生黄曲霉毒素M1（AFM1）以及黄曲霉毒素M2（AFM2） [3 ]。

ZER及其代谢产物具有雌激素类物质的生物活性，能与雌激素受体相互作用， 产生一系列的毒副作用，包括生殖毒性 [4，5 ]、遗传毒性 [6 ]、基因毒性 [7 ]、免疫毒性 [8 ]等，还可影响机体内分泌系统，导致内分泌紊乱，影响激素调节水平 [9，10 ]。AFs对人和动物的健康具有严重的威胁，其毒性包括DNA损伤和基因突变 [11 ]、致癌性 [12 ]、免疫毒性 [13 ]、生殖和生长毒性 [14 ]等，其中AFB1毒性比砒霜大68倍，致癌性是3，4苯并芘的4000倍 [15 ]，被国际癌症研究机构归为一类致癌物质。农业部2002年235号公告明确规定玉米赤霉醇在动物性食品中不得检出 [16 ]；食品中黄曲霉毒素多以AFB1和AFM1的形式检出，我国食品中AFB1的限量标准为0.5～20.0 μg/kg，AFM1的限量标准为0.5 μg/kg [17 ]。

动物被喂食真菌毒素污染的谷物及饲料后，组织（如牛羊肉、动物肝脏等）中可能会残留真菌毒素，等通过食物链传给食用者，对其健康构成潜在危害。因此建立高灵敏度、特异性、简便、快速的毒素残留分析方法非常必要。目前，有关ZER和AFs的测定方法有酶联免疫分析法（ELISA） [18～20 ]、高效液相色谱法（HPLC） [21～23 ]、液相色谱质谱法（LCMS/MS） [24～26 ]等。ELISA具有较好的特异性及敏感性，且操作简便、快速，但容易受到复杂基质的干扰，出现假阳性结果；HPLC虽无GCMS的化学衍生化过程，但其灵敏度低、定性准确度不高；而HPLCMS/MS可对多组分同时进行定性和定量分析，且具有专属性强、选择性好、灵敏度高等优势，弥补了前述方法的不足，使得该技术在分析检验中得到了广泛应用。

与传统的液液萃取和固相萃取相比，免疫亲和柱具有特异性好、净化能力好、富集能力强等优点，本实验室在前期研究中建立了免疫亲和柱测定动物源食品中磺胺类药物 [27 ]、玉米赤霉醇类真菌毒素 [21 ]残留量的检测方法，但由于动物源食品中常多种残留兽药，采用单一的免疫亲和柱一次仅能测定其中的某种或者某类药物的含量。为了满足动物源食品中不同种类兽药残留的同时测定要求，本研究组进行了复合免疫亲和柱在食品分析中的应用研究 [28 ]。在此基础上，本研究建立了复合免疫亲和柱净化液相色谱串联质谱法测定动物源食品中6种黄曲霉毒素和6种玉米赤霉醇类真菌毒素残留量的方法，考察了复合免疫亲和柱的性能，优化了样品前处理方法。本方法的提取效率高，重现性好。相比本实验室前期建立的玉米赤霉醇类真菌毒素残留的检测方法，本研究采用复合免疫亲和柱，可同时对ZER和AFs两类物质富集净化；样品采用混合溶剂一步提取，更加简便、快速，检出限和定量限更低，方法更加灵敏。本方法为动物源食品中ZER和AFs的同时检测提供了重要参考。

3结果和讨论

3.1样品前处理条件的优化

3.1.1待净化溶液中有机相的含量考察了待净化溶液中有机相含量对IACAZ柱富集效果的影响。结果表明，当有机相含量≤20%时，ZER和AFs的回收率无明显差别；当有机相含量>20%时，随着有机相含量的增加，ZER和AFs的回收率明显下降。因此，待净化上载溶液中有机相的含量控制在20%以内。

3.1.2柱洗脱剂的选择

取0.5 mL 1 μg/L混合标准溶液，用PBS稀释至10 mL，上柱、淋洗后，分别用6 mL的甲醇、乙腈、无水乙醇作为洗脱剂进行洗脱，收集洗脱液进行分析。结果表明，5 mL水和5 mL PBS淋洗柱子， 能够洗脱杂质且无目标分析物洗脱，当使用乙腈作为洗脱剂时，各目标待测物的洗脱率大于90%，故本实验最终选定乙腈作为柱洗脱剂。随着乙腈的用量增加，目标物的回收率随之提高，当乙腈体积大于3 mL 时，回收率趋于稳定。因此，本方法采用3 mL乙腈作为柱洗脱液。

3.1.3提取溶剂的选择玉米赤霉醇及其类似物为脂溶性物质，不溶于纯水，溶于碱性水溶液和大多数有机溶剂，文献报道的常用提取溶剂有乙醚、乙腈、叔丁基甲醚等 [21，29 ]。黄曲霉毒素类真菌毒素难溶于水，易溶于油及甲醇、丙酮和氯仿等有机溶剂，文献报道的常用提取溶剂为甲醇水或者乙腈水的混合溶剂 [30，31 ]，本实验在样品中添加5 μg/kg 目标物，比较了甲醇、乙腈、甲醇水、乙腈水、甲醇乙腈的提取效率（图1）。结果表明，单一溶剂的提取效率都不理想，甲醇乙腈（20∶80， V/V）的提取效果較好，12种目标待测物的提取回收率均大于90%。

图1不同溶剂对基质中ZER 和AFs 的提取回收率

Fig.1Extraction recoveries of ZER and AFs in matrices with different solvents

3.2基质效应的评价

本研究采用空白基质溶液和标准溶液分别配制相同浓度的基质效应曲线，基质效应ME（%）如下式[32]。

ME（%）=（K1/K2-1）×100%

其中K1和K2分别为基质匹配标准溶液所作曲线的斜率和无基质标准溶液所作曲线的斜率。对12种真菌毒素进行基质效应的评价，结果表明：猪肉中各分析物的基质效应值在

Symbolm@@ 4%～2%之间，鱼肉中各分析物的基质效应值在

Symbolm@@ 12%～7%之间，肝脏中各分析物的基质效应在

Symbolm@@ 1%～13%之间，均在±15%以内，表明样品经免疫亲和柱净化后没有明显的基质效应，可以用无基质标准溶液制作标准曲线，采用外标法定量。

3.3方法验证

3.3.1线性方程、检出限及定量限分别配制6种玉米赤霉醇类真菌毒素（0.05，0.1，0.5，1.0，5.0，10.0和20.0 μg/L）和6种黄曲霉毒素类真菌毒素（AFB1， AFG1， AFM1和AFM2为0.05，0.1，0.5，1.0，5.0，10.0和20.0 μg/L；AFB2和AFG2为0.03，0.15，0.3，1.5，3.0和6.0 μg/L）系列混合标准溶液。在最优条件下测定，以峰面积为纵坐标（y），标准溶液的质量浓度（μg/L） 为横坐标（x），得到线性回归方程，相关系数均大于0.999，表明各真菌毒素在其线性范围内呈良好的线性关系（见表3）。采用标准添加法进行测定，以定量离子信噪比（S/N≥3）计算方法的检出限为0.01～0.03 μg/kg；以信噪比（S/N≥10） 计算方法的定量限为0.04～0.09 μg/kg。

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