基于高效液相色谱法对不同提取条件下竹叶黄酮中牡荆苷含量的分析

华　梅　谭　芮　王　毅　缪福俊　陈　剑　马惠芬　杨宇明　王　娟

(云南省林业科学院，云南省森林植物培育与开发利用重点实验室，国家林业局云南珍稀濒特森林植物保护和繁育重点实验室，云南 昆明 650201)



基于高效液相色谱法对不同提取条件下竹叶黄酮中牡荆苷含量的分析

华梅谭芮王毅缪福俊陈剑马惠芬杨宇明王娟

(云南省林业科学院，云南省森林植物培育与开发利用重点实验室，国家林业局云南珍稀濒特森林植物保护和繁育重点实验室，云南 昆明 650201)

用高效液相色谱对竹叶黄酮中牡荆素进行分析，并对其含量进行了测定，同时研究了提取溶剂比、料液比和提取时间对牡荆素含量的影响。结果表明：最佳的提取条件为，提取溶剂比为70%乙醇水，料液比为1∶20，提取时间为2.0 h。采用牡荆苷作为外标物，建立牡荆苷标准曲线方程：m=4.725 × 10-7A+ 0.042 5 (R2=0.999)。在最佳的提取条件下，采用大孔树脂对提取物进行纯化，对竹叶黄酮中牡荆素的含量进行测定，灰金竹中牡荆素的含量为 (1.01% ± 0.07%)。

竹叶黄酮；牡荆素；提取条件；外标法；高效液相色谱

竹叶的医疗保健作用早已为中国人所认识， 《本草纲目》 记载：苦竹 (Pleioblastusamarus)叶具有明目利九窍、治不睡、止消渴、解酒毒等作用；淡竹 (Phyllostachysnigravar.henon) 叶具有镇静、解热、止咳和止血的功效[1]。 《中药大辞典》 记载：淡竹叶有清热解烦，生津利尿；治热病烦渴，小儿惊痫，咳喘吐血，面赤，小便短赤，口糜舌疮等功用[2]。近年研究表明，竹叶提取物具有优良的抗自由基、抗氧化、抗衰老、抗菌、杀虫、调节血脂以及保护心脑血管等生物活性和药理功效[3-6]。 竹提取物的毒理学安全性评价结果表明：小鼠经口致死中量 (LD50) 大于10 g/kg。根据LD50的分级标准，竹提取物为实际无毒[7]。竹子的生长周期短，在中国绝大多数地区都能种植，生物资源量非常丰富。但目前竹子的大量利用仅限于竹笋、竹屋、竹装饰品等竹原料产品，对竹子的副产品竹叶的开发利用较少。

竹叶具有非常高的药用价值，竹叶中主要的活性物质为黄酮，将竹子中竹叶黄酮进行深入的开发利用，将对人类的健康具有重大意义。目前已报道的竹提取物的化学成分包括黄酮、苷类、活性多糖类、特种氨基酸、肽类、芳香成分以及锰、锌、硒等多种微量元素[8-9]。黄酮具有2-苯基色原酮结构化合物的总称，在植物中普遍存在。竹提取物中发现的黄酮类化合物主要是黄酮苷， 以在6、8位的碳苷黄酮为主， 如荭草苷、异荭草苷、牡荆苷和异牡荆苷等[10]。

牡荆素 (牡荆苷) 主要用于治疗心血管疾病，已有成药注射用牡荆素用于临床医疗。牡荆素主要功能是活血化瘀，理气通脉。用于瘀血阻脉所致的胸痹，症见胸闷憋气，心前区刺痛、心悸健忘、眩晕耳鸣。冠心病心绞痛、高脂血症、心动脉供血不足等症候者[11-12]。目前牡荆素主要来源于蔷薇科植物山楂 (Crateaguspinnatifida) 干燥成熟的果实中，而山楂果实的资源量有限，从资源量大的其他植物中开发牡荆素具有非常重要的意义。竹子种植面积大，而且能在条件苛刻的地区生长，资源丰富，因此从竹叶中开发牡荆素，建立牡荆素的分析检测方法，对竹叶产品及牡荆素的开发利用具有非常重要的意义。

基于竹叶黄酮中牡荆素具有较高的药用价值，因此，研究竹叶黄酮中牡荆素含量的测定对产品的开发非常重要。本研究采用高效液相色谱法对竹叶黄酮提取物中牡荆素的含量进行分析测定，直接采用牡荆苷作为外标法的标准品，使得测量结果更为准确。同时考察了不同提取条件 (料液比、提取溶剂比、提取时间) 对竹叶黄酮提取物中牡荆苷含量的影响，采用大孔树脂对提取物进行纯化，为竹叶黄酮中牡荆素产品开发及利用提供依据。

1　材料与方法

1.1竹叶样品预处理

将新鲜竹叶先以清水漂洗，再以蒸馏水冲洗，自然晾干后，用微型植物粉碎机进行粉碎，过60目筛备用。

1.2试验方法

1.2.1竹叶黄酮中牡荆素提取条件的优化

精确称取干燥粉碎的竹叶 2 g (5份)，置于250 mL圆底烧瓶中，加入乙醚50 mL，过夜萃取以除去脂溶性成分，过滤，弃去乙醚部分溶液。再分别加入 0%、30%、60%、70%、95% (v/v) 乙醇水溶液，料液比分别设为1∶1、1∶5、1∶10、1∶20、1∶30、1∶50。加热回流，70 ℃回流3次。提取时间设置为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h。回流后，合并3次回流液，过滤，取上述各乙醇回流后的提取液，分别用3倍石油醚萃取3次，留取下层溶液，浓缩待用。通过提取试验，分别考察提取时间、溶剂比和料液比对竹叶黄酮中牡荆素含量的影响，确定最佳的提取条件。

1.2.2大孔树脂的预处理

大孔树脂参照文献 [1,3] D101 (非极性树脂) 的方法处理，先用95%的乙醇溶液充分浸泡，然后用乙醇漂洗，当洗出液加适量水后无白色浑浊，再用去离子水洗尽乙醇，转入酸碱处理。用 5% HCl 溶液浸泡3 h，然后用去离子水洗至pH为中性；接着用质量浓度50 g/L NaOH溶液浸泡3 h；最后用去离子水洗至pH为中性。

1.2.3样品纯化

将处理好的大孔树脂装柱，做好标记。将不同溶剂比的提取液浓缩后分别直接上柱，收集直接流下来的溶液做好标记。接着用水冲洗，收集流下的溶液。再用70%乙醇-水冲洗，当洗脱液无黄酮显色反应后浓缩，得到较纯的总黄酮提取液。

1.3高效液相色谱法测定竹叶黄酮中牡荆苷的含量

1.3.1样品溶液的准备

将上述经过大孔树脂纯化的各提取液用含量70%乙醇定容至250 mL，以测定竹叶黄酮中牡荆苷的含量。将上述提取液分别过0.45 μm滤膜，用于HPLC分析。

1.3.2标准样品溶液的准备

准确称取25 mg牡荆素标准样品，用无水乙醇溶解定容至25 mL，配成100 mg/mL的标准样品溶液备用。将标准样品溶液分别过0.45 μm滤膜，用于HPLC分析。

1.3.3高效液相色谱条件

色谱仪： Agilent 1260型高效液相色谱仪，Ecli-

pse plus C18色谱柱 (4.6 × 150 mm, 5 μm)。

流动相：A为水 (1%乙酸)，B为甲醇，流速为1.0 mL/min，温度为30 ℃

洗脱条件 (梯度洗脱)：平衡20% B，20%～60% B (15 min)，60%～80% B (10 min)

检测波长：330 nm

1.3.4标准曲线的制作

将上述配好的100 mg/mL标准样品溶液以0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 μL的浓度梯度进样，在上述色谱条件下检测，测定结果用于绘制标准曲线。

1.3.5竹叶黄酮中牡荆素提取液含量的测定

在上述色谱条件下，分别取5.0 μL定容好的提取液进样，采用外标法测定各提取液中牡荆苷的含量。

1.4数据处理

采用高效液相色谱面积归一化法及外标法，测定最佳提取方法下不同竹子中牡荆素的含量。

2　结果与分析

2.1标准品色谱图及曲线

牡荆苷的HPLC色谱图见图1。从图1可以看出，牡荆苷的保留时间Rt为10.522。牡荆苷的标准曲线见图2，标准曲线回归方程为：m=4.725 × 10-7A+ 0.042 5 (R2=0.999)。

图1牡荆苷色谱图

Fig.1Chromatogram of Vitexin

图2牡荆苷标准曲线

Fig.2Calibration curve of Vitexin

2.2灰金竹样品色谱图

灰金竹样品的色谱图见图3。从图3可以看出，灰金竹黄酮提取液中存在的成分较多。但是在大孔树脂纯化下，根据高效液相色谱面积归一化可知，虽然杂峰比较多，但是样品中40%的物质主要为牡荆苷。

2.3提取溶剂比例对牡荆苷含量的影响

通过高效液相色谱外标法，对不同溶剂比提取下灰金竹中牡荆素含量进行测定，结果见表1。从表1可知，灰金竹在70%的提取溶剂比下牡荆素的含量更高一些，后续条件的优化在70%的提取溶剂比下进行。

图3灰金竹样品的色谱图

Fig.3　Chromatogram of Phyllostachys nigra var. henonis Stapf ex Rendleis

2.4料液比对竹叶黄酮含量的影响

在最佳的提取溶剂比下，分别考察了料液比对竹叶黄酮中牡荆苷含量的影响。料液比分别为1∶1、1∶5、1∶10、1∶20、1∶30、1∶50，不同料液比竹叶黄酮中牡荆苷含量见图4。当料液比达到1∶20以后，竹叶黄酮中牡荆素的含量变化幅度减小，增加提取溶剂对牡荆素的得率没有多大影响。考虑到实验及生产成本，特选取1∶20的料液比为最佳的提取条件。

图4料液比对牡荆苷含量的影响

Fig.4Influence of solid-liquid ratio on Vitexin content

2.5提取时间对竹叶黄酮中牡荆苷含量的影响

在最佳的提取溶剂及料液比下，分别考察了提取时间对竹叶黄酮中牡荆苷含量的影响，提取时间比分别为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h。由图5可知，当提取时间达到2.0 h后，再增加提取时间，牡荆苷的含量增加不大。考虑到实验和实际生产成本，选取2.0 h作为竹叶黄酮中牡荆苷最佳的提取时间。

图5提取时间对牡荆苷含量的影响

Fig.5 Influence of extraction time on Vitexin content

2.6HPLC对竹叶黄酮提取物中牡荆苷含量的测定

在最佳的提取条件下，即提取溶剂比为70%乙醇水，料液比为1∶20，提取时间为2.0 h。在大孔树脂纯化后，通过HPLC对灰金竹黄酮提取物中牡荆苷的含量进行5次测定 (n=5)，牡荆苷含量测定结果分别1.08%、1.03%、0.89%、1.02%、1.04%，平均值为1.01%。从分析结果可知，灰金竹中牡荆苷的含量为1.01% ± 0.07%，与文献 [14] 报道的相近。因此，灰金竹可作为牡荆苷产品开发的又一新资源。

3　结论与讨论

本研究通过高效液相色谱外标法对竹叶黄酮提取物中牡荆苷进行了分析并对含量进行了测定，研究直接采用牡荆苷作为外标法的标准对照品，使得竹叶黄酮提取物中牡荆苷的含量测量结果更为准确。研究同时考察了牡荆苷提取所需溶剂比、料液比和提取时间对竹叶黄酮中牡荆苷含量的影响，结果表明，最佳的提取条件为：提取溶剂比为70%乙醇-水，料液比为1∶20 (g/V)，提取时间为2.0 h。采用大孔树脂对提取物进行优化，优化的目的是除去提取液中的多糖，使测试结果更为准确。在最佳的提取条件下，对竹叶黄酮中牡荆苷的含量进行了测定，灰金竹中牡荆素的含量为1.01% ± 0.07%。竹叶黄酮提取物中牡荆素含量测定方法的考察，为竹叶成为牡荆苷开发的新资源提供参考依据。

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(责任编辑韩明跃)

Analysis for Vitexin Content of Bamboo Leaves Flavonoids in Different Extraction Condition with High Performance Liquid Chromatography (HPLC)

Hua Mei, Tan Rui, Wang Yi, Miao Fujun, Chen Jian, Ma Huifen, Yang Yuming, Wang Juan

(Key Laboratory of Forest Plants Cultivation & Development and Utilization of Yunnan Province/Key Laboratory of Conservation and Breeding of Rare and Endangered Forest Plants in Yunnan Province of State Forestry Administration, Yunnan Academy of Forestry, Kunming Yunnan 650201, China)

We studied the Vitexin in flavonoids of bamboo leaves and measured the content with HPLC external standard method, simultaneously investigated the influences of extraction solvent ratio, solid to liquid ratio, and extraction time on the content of Vitexin in flavonoids of bamboo leaves. The results showed that the optimum extraction conditions were: extraction solvent ratio was 70% ethanol-water, solid-liquid ratio was 1∶20, extraction time was 2.0 h. We established the standard curve equationm=4.725 × 10-7A+ 0.042 5 (R2=0.999), using Vitexin as external standard substance and purifying extract with Macroporous resin. Under the optimum extraction conditions, the Vitexin content inPhyllostachysnigravar.henonisStapf ex Rendle was (1.01% ± 0.07%).

bamboo leaves flavonoids, Vitexin, extraction condition, external standard method, high performance liquid chromatography (HPLC)

10. 11929/j. issn. 2095-1914. 2016. 05. 027

2015-10-18

云南省应用基础研究重点项目 (2013FA054)；云南省科技计划 (对外科技合作计划) (2014IA013)；云南省应用基础研究计划青年项目 (2014FD069)；国家林业公益性行业科研专项项目 (201204110)；云南省重点实验室开放基金；云南省科技计划 (对外科技合作计划-国际科技合作) (2015IA005)；亚太森林网络 (APFNet)-联合国大学 (UNU) 跨国森林植被恢复项目 (600UU-1123)。

王娟 (1966—)，女，教授。研究方向：分子生物学与植物化学研究。Email: schima@163.com。

S795; Q946.8

A

2095-1914(2016)05-0164-05

第1作者：华梅 (1986—)，女，助理研究员。研究方向：森林植物有用成分研究。Email: huamm2005@163.com。